本发明涉及生化分析领域，具体的说，是通过高丰度蛋白去除技术和蛋白分级技术富集分泌蛋白，并对其进行质谱分析鉴定。
背景技术：
分泌蛋白泛指分泌到细胞外并发挥功能的一类蛋白质。分泌蛋白包括许多生长因子和细胞因子，广泛参与细胞信号传导，免疫应答，细胞的增殖，分化和凋亡的调控等众多生物体重要的生命活动。分泌蛋白质组的深入研究有助于我们找到直接或间接与疾病状态相关的生物标志物，并在分子水平上对疾病的发生发展提供理论依据。
针对不同分泌系统的分泌蛋白质组学的研究是近年来蛋白质组学的研究热点，特别是针对不同类型、不同阶段的癌细胞具有十分重要的研究意义。传统的分泌蛋白质组研究策略绝大多数采用无血清的培养条件，以避免高丰度血浆蛋白质组对分泌蛋白本身造成的极大背景干扰。然而，对于细胞而言，无血清培养这种饥饿应激会改变细胞自身的分泌行为，甚至激活细胞凋亡途径。这样，鉴定的分泌蛋白质组反映的是细胞非正常状态下的分泌蛋白质组。为了解决这一难题，Eichelbaum与其合作者开发了一种叠氮化合物代谢标记并通过点击化学富集分泌蛋白的策略，从血清培养基中鉴定了325个严格意义上的分泌蛋白，分泌蛋白选择性达到71％(Eichelbaum et al.,Nat.Biotechnl.30,2012)。然而，该方法采用了叠氮化合物代谢标记以替代甲硫氨酸的策略，虽然该方法摆脱了血清饥饿的桎梏但对细胞而言同时却是一种甲硫氨酸饥饿的状态，会对细胞的生长的增殖产生不可预知的影响，不能反映正常培养状态下的细胞。
基于此，我们发展了一种直接处理血清培养液的分泌蛋白样品预处理方法。仅仅通过对培养液进行高丰度蛋白的去除和蛋白的分级，就能达到大规模鉴定分泌蛋白质组的目的，同时不影响细胞正常的生理状态。
技术实现要素：
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
取含血清的细胞培养液，经离心、过滤处理，再依次利用高丰度蛋白去除技术和蛋白分级技术处理，并对其进行酶解。
所述含血清的细胞培养液为含1％-30％胎牛血清并用于细胞培养的SILAC培养液；上述SILAC培养液是含同位素标记的赖氨酸，精氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺中一种或二种以上的组合的细胞培养液。
所述离心、过滤处理，具体为先利用300-700g的离心力去除细胞，离心时间为1-60分钟；取上清再用2000-5000g的离心力去除细胞碎片，离 心时间为1-60分钟，取上清用0.1-1.0μm的滤膜过滤，取滤液。
所述高丰度蛋白去除技术是抗体柱去除技术或蛋白质均衡技术的一种或两种；抗体柱去除技术是利用若干种固定化的抗体对其特定的高丰度蛋白实现特异性捕获达到去除的目的；蛋白质均衡技术是利用特定的材料对蛋白质实现均衡，以降低高丰度蛋白含量，提高低丰度蛋白含量。
所述蛋白分级技术是蛋白等电点分级技术或蛋白分子量分级技术的一种或两种。蛋白等电点分级技术是利用蛋白质不同的等电点性质对其进行分离；蛋白分子量分级技术是利用蛋白质不同分子量的性质对其进行分离。
所述酶解是蛋白在胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或蛋白内切酶的一种或任意两种的作用下，将蛋白水解为肽段；酶的加入量为1:1-1:200(酶：蛋白，质量比)；酶解条件为20-50摄氏度下酶解1-48小时。
具体为：首先收集细胞培养液，然后对其进行第一步低转速的离心处理(300-700g)以除去残留的细胞，再进行第二步较高转速的离心处理(2000-5000g)以除去残留的细胞碎片。接着，用0.1-1.0μm的滤膜进一步除去培养液中的细胞和细胞碎片。然后，利用高丰度蛋白去除技术(抗体柱去除技术或蛋白质均衡技术)除去细胞培养液中的高丰度蛋白，并利用蛋白分级技术(蛋白等电点分级技术或蛋白分子量分级技术)对处理后的培养液进行蛋白的分级。接着，对不同级分的蛋白分别在胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或蛋白内切酶的任意一种或一种以上的组合的作用下进行酶解。最后，对获得的肽段用飞行时间类质谱，离子阱类质谱和轨道阱类质谱中的一种或一种以上的组合进行质谱分析。
与传统无血清培养富集分泌蛋白相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明可以克服血清饥饿对细胞的影响，维持细胞正常的生理状态；
(2)本发明可以减少细胞的破碎以降低细胞核内蛋白的干扰；
(3)本发明可以反映正常的条件下细胞分泌蛋白的真实结果。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
以下提供本发明两种富集和鉴定分泌蛋白的具体实施方式。
实施例1
利用ProteoMiner均衡器材料和Gelfree 8100蛋白分级仪器对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(K6，R10)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接 着，取上清用0.22μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用ProteoMiner均衡器处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白同时富集低丰度蛋白，再利用Expedeon公司的Gelfree 8100对蛋白进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL 0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL0.2M的碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
ProteoMiner均衡器处理条件：首先将200μL60mg/ml的蛋白流穿组分与100mg ProteoMiner均衡器材料在10mM HEPESpH＝7.0条件下室温孵育2h。孵育完成后，用10mM HEPES冲洗三次，与300μL洗脱液(4％SDS，25mM DTT)在95℃条件下孵育15min，然后进行500g离心洗脱产物。洗脱液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
Gelfree 8100蛋白分级处理条件：按照仪器的使用说明，取20μL SampleBuffer和10μL Running Buffer(由仪器厂家提供)，8μL 1M的二硫苏糖醇与112μL待处理样品混合置于仪器的样品槽，按照仪器推荐的程序电压设置对样品进行分级，分别在56.5，58.5，60.5，62.5，65.5，68.5，73.5，80，90，120分钟收集馏分，一共收集十个馏分。
实施例2
利用MARS-14抗体柱和尺寸排阻色谱技术对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(K6)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接着，取上清用0.45μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用MARS-14抗体柱处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白，再利用尺寸排阻色谱柱(5μm，)对蛋白进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL 0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL 0.2M的碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
MARS-14抗体柱处理培养液：首先将20μL流穿组分与40μLBuffer A(Agilent,5185-5987)混合，通过液相色谱系统，以0.125mL/min的流速流经抗体柱，并收集流穿液。流穿液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
尺寸排阻色谱对蛋白进行分子量分级：将100μL流穿组分用1×PBS进行稀释5倍，通过液相色谱系统，以0.3mL/min的流速流经尺寸排阻色谱柱，并收集15,17,19,21,23,25,27,29,31,33分钟的馏分，一共收集十个馏分。
实施例3
利用ProteoPrep20抗体柱和尺寸排阻色谱技术对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(R10)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接着，取上清用0.22μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用ProteoPrep20抗体柱处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白，再利用尺寸排阻色谱柱(5μm，)对蛋白进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL 0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL 0.2M的碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
ProteoPrep20抗体柱处理培养液：首先将20μL流穿组分与40μL Buffer A(Agilent,5185-5987)混合，通过液相色谱系统，以0.125mL/min的流速流经抗体柱，并收集流穿液。流穿液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
尺寸排阻色谱对蛋白进行分子量分级：将100μL流穿组分用1×PBS进行稀释5倍，通过液相色谱系统，以0.3mL/min的流速流经尺寸排阻色谱柱，并收集15,17,19,21,23,25,27,29,31,33分钟的馏分，一共收集十个馏分。
实施例4
利用SuperMix抗体柱和Gelfree 8100蛋白分级仪器对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(R6)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接着，取上清用0.45μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用SuperMix抗体柱处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白，再利用Expedeon公司的Gelfree 8100对蛋白进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL 0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL 0.2M的碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
SuperMix抗体柱处理培养液：首先将20μL流穿组分与40μL Buffer A(Agilent,5185-5987)混合，通过液相色谱系统，以0.125mL/min的流速流经抗体柱，并收集流穿液。流穿液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
Gelfree 8100蛋白分级处理条件：按照仪器的使用说明，取20μL SampleBuffer和10μL Running Buffer(由仪器厂家提供)，8μL 1M的二硫苏糖醇与112μL待处理样品混合置于仪器的样品槽，按照仪器推荐的程序电压设置对样品进行分级，分别在56.5，58.5，60.5，62.5，65.5，68.5，73.5，80，90，120分钟收集馏分，一共收集十个馏分。
实施例5
利用ProteoMiner均衡器材料和3100Offgel Fractionator蛋白分级仪器对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(K6)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接着，取上清用0.22μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用ProteoMiner均衡器处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白同时富集低丰度蛋白，再利用3100Offgel Fractionator分级仪器对蛋白等电点进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL 0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL 0.2M的碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
ProteoMiner均衡器处理条件：首先将200μL 60mg/ml的蛋白流穿组分与100mg ProteoMiner均衡器材料在10mM HEPES pH＝7.0条件下室温孵育2h。孵育完成后，用10mM HEPES冲洗三次，与300μL洗脱液(4％SDS，25mM DTT)在95℃条件下孵育15min，然后进行500g离心洗脱产物。洗脱液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
3100Offgel Fractionator蛋白分级处理条件：按照仪器的使用说明，取2.88mL1.25×OFFGEL储备液(由仪器厂家提供)和0.72mL水，与待处理样品混合置于仪器的样品槽，采用pH 3-10的胶条，按照仪器推荐的电压设置(200V-1500V)对样品在胶条上进行分级，一共收集十个馏分。
实施例6
利用ProteoPrep20和3100Offgel Fractionator蛋白分级仪器对SILAC标记的HeLa细胞培养液实现分泌蛋白的富集和鉴定。
首先收集SILAC标记(K6，R10)的HeLa细胞的培养液，500g离心以除去残留的细胞，取上清再进行3000g离心以除去残留的细胞碎片。接着，取上清用0.45μm的滤膜进行过滤以进一步除去细胞碎片，并收集流穿组分。然后，利用ProteoPrep20处理流穿组分以除去其中的高丰度蛋白同时富集低丰度蛋白，再利用3100Offgel Fractionator分级仪器对蛋白等电点进行分子量的分级，并收集每个馏分。接着，每个馏分中的蛋白加入100μL0.1M的二硫苏糖醇56摄氏度变性还原2小时，再避光加入100μL 0.2M的 碘乙酰胺室温烷基化反应半小时，接着加入1mL 50mM的碳酸氢铵，再加入胰蛋白酶(1:50，酶：蛋白，质量比)37摄氏度孵育16小时，接着用除盐柱对样品除盐，最后进行nano-ESI-LC-MS/MS质谱分析。
ProteoPrep20抗体柱处理培养液：首先将20μL流穿组分与40μL Buffer A(Agilent,5185-5987)混合，通过液相色谱系统，以0.125mL/min的流速流经抗体柱，并收集流穿液。流穿液即为去除了高丰度蛋白后的培养液。
3100 Offgel Fractionator蛋白分级处理条件：按照仪器的使用说明，取2.88mL 1.25×OFFGEL储备液(由仪器厂家提供)和0.72mL水，与待处理样品混合置于仪器的样品槽，采用pH 3-10的胶条，按照仪器推荐的电压设置(200V-1500V)对样品在胶条上进行分级，一共收集十个馏分。