本发明属于生物化学检测分析技术领域，具体涉及一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统和方法。
背景技术：
蛋白质作为生物体的基本组成物质，也是生物体各种功能的执行者，对蛋白质组成、结构和功能的研究将直接阐明生命体在生理或病理条件下的变化机制。研究表明，人体内有三分之一的蛋白与金属元素结合形成金属蛋白(包括金属酶)。在这些金属蛋白中，金属离子(通常为过渡金属离子，比如铜、铁、锌或钼)作为活性中心或协同因子参与完成蛋白的催化、调节或者结构功能等作用。金属与蛋白质之间的相互作用在很大程度上决定了许多蛋白质的功能以及金属药物的药效。金属组学的一个重要目的是识别金属蛋白质(金属酶、金属输运蛋白质和金属应激蛋白质)，特别是蛋白质的金属结合位点，因此证实生物体系中存在金属蛋白并对不同种类的金属蛋白进行分离和检测具有十分重要的意义。
目前测定金属蛋白的技术主要有以液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)和凝胶电泳(GE)为基础的分离技术，以放射自显影技术、X射线荧光分析、中子活化分析等核心技术为基础的测定技术和以元素质谱(ICP-MS)与分子质谱(ESI/MALDI-MS)为基础的鉴定技术。关于金属蛋白的分离检测方法已有一些文献报道，但对于复杂蛋白样品的分离检测仍缺乏高效稳定的方法。Szpunar等报道了HPLC在金属蛋白方面的应用，此技术用于分离生物样品的金属蛋白时，对蛋白结合金属影响较小，其局限性主要表现在分离分辨率不够高，且色谱分离所用的流动相中的有机物和盐分对后续与之在线联用的ICP-MS元素检测有影响。近年来发展的毛细管区带电泳-电感耦合等离子体质谱(CZE-ICP-MS)，由于具有高选择性和灵敏度，成为分析生物分子的有力工具，但CZE进样量低且气流的稀释作用对后续元素分析的灵敏度有一定影响。对于金属蛋白的分离，CE需要极高的工作电压(10～40kV)，也可能造成蛋白结合金属的丢失，目前CZE-ICP-MS多用于方法研究，在实际样品中的应用仍有限。Tomlinson等分别利用SDS-PAGE和Native-PAGE两种凝胶电泳方法结合LA-ICP-MS技术对血清中Pt结合蛋白进行分析，发现通过Native电泳分离后的凝胶中可以检测到含Pt蛋白，而SDS-PAGE则造成蛋白结合Pt的丢失，但Native电泳对复杂蛋白样品分辨率较差。总之，目前还缺乏可用于复杂样品中金属蛋白的有效分离和灵敏检测的方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种具有较高分离度和分辨率的用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统和方法。
为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统，包括阴离子交换柱、柱状电泳仪和电感耦合等离子体质谱仪，其中使用所述阴离子交换柱的离子交换色谱分离技术与使用所述柱状电泳仪的凝胶电泳采用离线联用，使用柱状电泳仪的凝胶电泳与电感耦合等离子体质谱仪采用在线联用；以及
检测样品经所述阴离子交换柱进行第一维的初步分离，初步分离产物再经所述柱状电泳仪和电感耦合等离子体质谱仪进行第二维的分离和检测。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的方法，包括以下步骤：
采用离子交换色谱分离技术作为第一维分离方法，根据蛋白质等电点不同对检测样品进行初步分离，收集初步分离产物；
以凝胶电泳作为第二维分离方法，通过聚丙烯酰胺凝胶柱对上述初步分离产物进行再次分离；
通过电感耦合等离子体-质谱对上述再次分离产物中的金属离子和非金属离子进行定性与定量检测。
基于上述技术方案可知，本发明采用离子交换色谱-柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱联用技术，采用两维方法分离金属蛋白和小分子化合物，并用ICP-MS对其中的金属离子和非金属离子进行定性定量分析，实现了金属蛋白和小分子化合物的在线分离和检测。实验表明，IEC-GE-ICP-MS联用方法分离检测金属蛋白和小分子化合物具有操作简单、系统死体积小、分离效率高、检测灵敏度高、分析时间短、样品用量少、应用范围广等特点。本发明结合高效、快速分离的离子交换色谱、柱状凝胶电泳和高灵敏度、高选择性、多元素同时检测的ICP-MS建立了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的方法。该方法不仅可用于金属蛋白的分离和检测，还可用于小分子化合物的分离及不同元素的检测，并且能推广应用于其他生物大分子的分离和检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的分离检测金属蛋白及金属离子、非金属离子的IEC-GE-ICP-MS联用系统示意图；
图2是六种I-蛋白经离子交换色谱分离的一维谱图；
图3是六种I-蛋白经离子交换色谱分离的各组分的SDS-PAGE谱图；
图4是六种I-蛋白经IEC-GE-ICP-MS分离检测的三维谱图；
图5是绿脓杆菌暴露硝酸银后水溶性蛋白经离子交换色谱分离的一维谱图；
图6是绿脓杆菌暴露硝酸银后水溶性蛋白经离子交换色谱分离的SDS-PAGE谱图；
图7是绿脓杆菌中银蛋白凝胶电泳谱图；
图8是汞蛋白凝胶电泳谱图；
图9是碘酸钾、碘化钾及I-蛋白经GE-ICP-MS分离的色谱图。
图1中：1.蛋白样品，2.DEAEFE离子交换柱，3.组分收集器，4.柱状凝胶电泳体系，5.凝胶柱，6.电泳缓冲液，7.洗脱液，8.洗脱液引流装置，9.滤芯及滤膜，10.外加电压，11.PEEK液相管路三通，12.蠕动泵，13.ICP-MS，14.组分收集器，15.根据等电点和分子量分离得到的蛋白谱图，16.蛋白质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
离子交换色谱不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且也可用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离，HiTrapDEAEFE(阴离子型)离子交换柱具有性质稳定、流速好、分离能力强等优点，可对不同等电点的蛋白质进行快速分离。柱状凝胶电泳是一种高效、快速的蛋白分离方法，同时具有分离范围广、分离度高、样品消耗量少、操作简便等优点，不同分子量的蛋白质可在对应浓度的聚丙烯酰胺凝胶中得到分离。将离子交换色谱和柱状凝胶电泳串联使用，可提高整个系统的分离分辨率和峰容量，能够满足蛋白质组学研究高通量的要求。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)目前被广泛应用于复杂基质中金属元素及非金属元素的分析，由于其检测限低，且可简便快捷地完成多元素分析，与各种色谱的联用技术被用于生物分子形态分析。除了检测金属蛋白中的金属元素外，ICP-MS还可用于检测蛋白中的非金属元素(P，S，N)以及与蛋白质以共价键结合的非金属元素(I，Se等)。两维分离方法(IEC-GE)与ICP-MS的联用可实现复杂基质中小分子化合物和金属蛋白的分离与检测。
本发明以离子交换色谱(IEC)、GE为分离技术，ICP-MS为检测器，建立了一种离子交换色谱-柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱联用方法，实现了金属蛋白和小分子化合物的分离和检测。IEC是以离子交换树脂为固定相、以水缓冲溶液为流动相、根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离的技术。由于不同金属蛋白带电性及等电点不同，蛋白与固定相亲合力不同，因此在IEC中可实现金属蛋白的初步分离。采用GE作为金属蛋白的第二维分离方法，利用梯度聚丙烯酰胺凝胶可对不同分子量范围的化合物和金属蛋白实现较好的分离效果。ICP-MS的引进为金属蛋白的研究提供了更宽的范围，它具有对元素的高选择性、高灵敏度以及多元素同时检测的优点，能够得到明确的定性定量的结果。通过IEC-GE与ICP-MS的联用，本发明实现了金属蛋白和小分子化合物的高效分离和灵敏检测。
本发明公开了一种分离检测系统，包括HiTrapDEAEFE离子交换柱、柱状电泳仪和电感耦合等离子体质谱仪，其中IEC-GE采用离线联用，GE-ICP-MS采用在线联用，蛋白样品经一维离子交换柱分离后收集馏分，再经GE-ICP-MS进行第二维的分离和检测。采用内径为2.5mm的柱状凝胶玻璃管，以3D打印的尼龙套管作为洗脱液引流装置，通过减小滤芯内径减小溶液死体积。洗脱液通过滤芯和滤膜过滤后由peek管导出，再经蠕动泵控制流速后引入ICP-MS。
本发明还公开了一种分离检测方法，具体包括以下步骤：
(a)HiTrapDEAEFE(阴离子型)离子交换柱安装在AKTATMavant全自动液相色谱系统(GEHealthcare)上，使用前用缓冲液B：20mMTris-HCl1.0MNaCl(pH7.4)和缓冲液A：20mMTris-HCl(pH7.4)分别冲洗10min，选用500μLloop环上样，上样环使用前用超纯水和缓冲液A分别冲洗3次。蛋白样品上柱后，先用A溶液(1.0mL/min)平衡，再用0-100％B溶液(1.0mL/min)梯度洗脱，分管500μL收集洗脱馏分，超滤管浓缩至20μL，随后上柱状凝胶电泳。
(b)将一维分离所得馏分与上样缓冲液混匀，用前端装聚四氟乙烯软管的注射器将样品注射到玻璃凝胶管中。
(c)进样之后，在聚丙烯酰胺凝胶两端先加入200V低电压，保持20min，使蛋白样品进入浓缩胶，随后将电压调高至1000V，柱状凝胶电泳管外壁用冷却水循环降温，电泳过程在低温环境下进行。由于小分子化合物以及各种金属蛋白的分子量不同，因而在凝胶中的迁移速度不同，一般小分子化合物先流出凝胶柱，金属蛋白按分子量由小至大依次被洗脱出来，因此金属蛋白和小分子化合物之间可实现有效的分离。
(d)金属蛋白和小分子化合物在柱状凝胶电泳中实现分离后，在凝胶柱末端即收集环处与外层引流管内的洗脱液混合，溶液经滤膜过滤后由peek管导出，经PEEK液相管路三通和蠕动泵，一半样品以140μL/min流速引入雾化室，被载气雾化后以气溶胶形式进入到ICP-MS进行检测。采用时间分辨分析(TRA)模式采集数据，通过电泳谱图中峰的保留时间确定金属蛋白的分子量，通过峰面积对其金属及非金属含量进行定量。
(e)对PEEK液相管路三通分流的另一半样品进行馏分收集，对感兴趣的蛋白进行进一步的鉴定及其他分析。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
标准和试剂：合成I-蛋白所用标准蛋白均购自美国Sigma公司。Tris购自美国Angus化学公司，碘、碘酸钾、氯化钠购自北京化工厂，硝酸铵购自天津市津科细化工研究所。制胶材料购自德国Merck公司。超纯水(DDW，18MΩ.cm)来自Milli-QAdvantageA10system(Millipore公司，美国)。
离子交换色谱操作条件：离子交换色谱柱(HiTrapDEAEFE，1mL)安装在AKTATMavant全自动液相色谱系统(GEHealthcare)上；洗脱液为A溶液：20mMTris-HCl(pH7.4)，B溶液：20mMTris-HCl1.0MNaCl(pH7.4)。使用前，色谱柱用B溶液冲洗10min，再用A溶液冲洗至平衡。采用500μLloop环将蛋白样品上DEAE柱，先用A溶液(1.0mL/min)平衡，再用0-50％B溶液(1.0mL/min)35min内梯度洗脱，分管500μL收集洗脱组分，超滤管浓缩体积至20μL，随后上柱状凝胶电泳。
凝胶电泳操作条件：MiniPrepCell电泳仪(Bio-RadLaboratories，Munich，Germany)，电泳仪电源(北京六一DYY-16D)，柱状凝胶玻璃管内径为2.5mm，长度为13cm，管内填充梯度聚丙烯酰胺凝胶，自下至上依次为：分离胶(8％1.5cm，10％1.5cm，13％1cm，15％0.4cm)，浓缩胶4％0.6cm。电泳电压程序为200V20min，1000V100min。样品上样量20μL，凝胶电泳温度设置为6℃。电泳缓冲盐溶液为：Tris-甘氨酸-SDS溶液。蛋白洗脱液为50mM的NH4NO3溶液，流速为140μL/min，洗脱液负载蛋白由雾化器引入ICP-MS。
ICP-MS系统及操作条件：8800型ICP-MS(安捷伦公司，美国)。入射功率为1500W，碰撞气流速为15.0L/min，载气流速为0.80L/min，辅助气流速为0.80L/min，雾室温度为2℃，质量数(m/z)为127I，积分时间为0.1秒。
GE-ICP-MS在线联用系统：如图1所示，GE-ICP-MS在线联用系统对电泳仪凝胶管及洗脱装置进行了改造，将原有内径为6.5mm的玻璃凝胶管改为内径为2.5mm的石英管5，从而减少样品上样量，同时提高分离度和分辨率；利用3D打印的尼龙套管作为洗脱液引流装置8将底部滤芯9尺寸改小为8.2mm，减小溶液死体积，从而提高分离度。蛋白样品分离洗脱后通过PEEK液相管路三通11经蠕动泵12控制以140μL/min流速分别引入ICP-MS13和组分收集器14。样品经雾室进入ICP-MS对金属元素和非金属元素进行检测。组分收集器收集样品进行后续的蛋白鉴定及其他检测。
梯度凝胶电泳的选择和优化：聚丙烯酰胺凝胶浓度直接决定所分离蛋白的分子量，实验考察了不同浓度配比的聚丙烯酰胺凝胶对I-蛋白的分离影响。最终确定管内填充梯度聚丙烯酰胺凝胶，自下至上依次为：分离胶(8％1.5cm，10％1.5cm，13％1cm，15％0.4cm)，浓缩胶4％0.6cm，此条件下分离效果较好，且ICP-MS的检测灵敏度较高。
参见图1，本发明具体实施过程如下：用0.1MTris-HCl配置0.1mg/mL的I-蛋白溶液，取500μL六种I-蛋白混合液上阴离子交换色谱柱，20mMTris-HCl(pH7.4)以1.0mL/min流速平衡5min，再用0-50％的20mMTris-HCl1.0MNaCl(pH7.4)以1.0mL/min流速35min内梯度洗脱，分管500μL收集洗脱组分，超滤管浓缩体积至20μL，随后上柱状凝胶电泳3。样品上样量20μL，凝胶电泳温度设置为6℃。电泳电压程序为200V20min，1000V100min。蛋白洗脱液以140μL/min流速经peek管引入到ICP-MS13进行检测，检测结果由信号采集装置记录。6种I-蛋白的在2h内实现分离，将一维离子交换色谱分离得到的各组分分别经第二维柱状凝胶电泳分离后由ICP-MS检测127I，可得到I-蛋白分离的三维谱图如图3所示。
实施例2
以硝酸银暴露后的金黄色葡萄球菌所提取水溶性蛋白为例，对其中的Ag-蛋白进行了分离和检测。
硝酸银购自国药集团化学试剂有限公司，所用菌种为绿脓杆菌(ATCC10145)。
样品及前处理方法：将提取的水溶性蛋白过0.22μm水系膜，测定蛋白浓度，用0.1MTris-HCl(pH7.5)稀释至浓度1mg/mL，直接进样进行分析测定。
IEC条件：离子交换色谱柱(HiTrapDEAEFE，1ml)安装在AKTATMavant全自动液相色谱系统(GEHealthcare)上；缓冲液为A溶液：20mMTris-HCl(pH7.4)，B溶液：20mMTris-HCl1.0MNaCl(pH7.4)。使用前，色谱柱用A溶液冲洗10min至平衡。采用500μLloop环将蛋白样品上DEAE柱，先用A溶液(1.0mL/min)平衡5min，再用0-50％B溶液(1.0mL/min)35min内梯度洗脱，分管500μL收集洗脱组分，超滤管浓缩体积至20μL，随后上柱状凝胶电泳。
GE条件：分离胶(8％0.5cm，10％1.5cm，13％1.5cm，15％1.0cm)，浓缩胶4％0.6cm。电泳电压程序为200V20min，1000V100min。样品上样量20μL，凝胶电泳温度设置为6℃。电泳缓冲盐溶液为：Tris-甘氨酸-SDS溶液。蛋白洗脱液为50mM的NH4NO3溶液，流速为140μL/min，洗脱液负载蛋白由雾化器引入ICP-MS。
ICP-MS系统及操作条件：入射功率为1300W，碰撞气流速为15.0L/min，载气流速为0.80L/min，辅助气流速为0.80L/min，雾室温度为2℃，质量数(m/z)为107Ag，积分时间为0.1秒。
实施例2的具体过程如下：将500μLAg-蛋白样品通过阴离子交换色谱柱，B溶液40min内梯度洗脱，收集馏分，分组通过注射器注入到玻璃凝胶管中，分离电压为200V20min，1000V100min。Ag-蛋白通过阴离子交换色谱柱和柱状凝胶实现分离，分离后进入ICP-MS进行金属检测。Ag-蛋白在120min内实现分离，电泳谱图如图7所示。结果显示，在硝酸银暴露后的金黄色葡萄球菌所提取总蛋白样品中检测出3种银蛋白。通过Ag-蛋白的出峰时间与6种标准I-蛋白的出峰时间比较，估算蛋白样品中三种Ag-蛋白的分子量分别为25kDa、45kDa、55kDa，经后续质谱鉴定可确定蛋白种类。
实施例3
以HgCl2孵育的标准蛋白为例，对其中的Hg-蛋白进行了分离和检测。
HgCl2购自国药集团化学试剂有限公司，标准蛋白均购自美国Sigma公司。
样品及前处理方法：测定HgCl2孵育过的标准蛋白浓度，用0.1MTris-HCl(pH7.5)稀释至浓度1mg/mL，直接进样进行分析测定。
IEC条件：离子交换色谱柱(HiTrapDEAEFE，1mL)安装在AKTATMavant全自动液相色谱系统(GEHealthcare)上；缓冲液为A溶液：20mMTris-HCl(pH7.4)，B溶液：20mMTris-HCl1.0MNaCl(pH7.4)。使用前，色谱柱用A溶液冲洗10min至平衡。采用500μLloop环将蛋白样品上DEAE柱，先用A溶液(1.0mL/min)平衡，再用0-50％B溶液(1.0mL/min)40min内梯度洗脱，分管500μL收集洗脱组分，超滤管浓缩至20μL，随后上柱状凝胶电泳。
GE条件：分离胶(8％0.5cm，10％1.5cm，13％1.5cm，15％1.0cm)，浓缩胶4％0.6cm。电泳电压程序为200V20min，1000V100min。样品上样量20μL，凝胶电泳温度设置为6℃。电泳缓冲盐溶液为：Tris-甘氨酸-SDS溶液。蛋白洗脱液为50mM的NH4NO3溶液，流速为140μL/min，洗脱液负载蛋白由雾化器引入ICP-MS。
ICP-MS系统及操作条件：入射功率为1300W，碰撞气流速为15.0L/min，载气流速为0.80L/min，辅助气流速为0.80L/min，雾室温度为2℃，质量数(m/z)为202Hg，积分时间为0.1秒。
实施例2的具体过程如下：将500μLHg-蛋白样品通过阴离子交换色谱柱，B溶液40min内梯度洗脱，收集馏分，分组通过注射器注入到GE玻璃凝胶管中，分离电压为200V20min，1000V100min。Hg-蛋白通过阴离子交换色谱柱和柱状凝胶实现分离，分离后进入ICP-MS进行金属检测。Hg-蛋白在120min内实现分离，电泳谱图如图7所示。结果显示，经HgCl2孵育的标准蛋白中检测出4种Hg-蛋白。
实施例4
碘酸钾、碘化钾均购自北京化工厂，I-RA、I-OVA、I-BSA为实验室合成碘代蛋白。
GE条件：分离胶(8％0.5cm，10％0.5cm，13％1.0cm，15％1.0cm)，浓缩胶4％0.6cm。电泳电压程序为200V20min，800V100min。样品上样量30μL，凝胶电泳温度设置为6℃。电泳缓冲盐溶液为：Tris-甘氨酸-SDS溶液。蛋白洗脱液为50mM的NH4NO3溶液，流速为140μL/min，洗脱液负载蛋白由雾化器引入ICP-MS。
ICP-MS系统及操作条件：入射功率为1500W，碰撞气流速为15.0L/min，载气流速为1.10L/min，辅助气流速为0.10L/min，雾室温度为2℃，质量数(m/z)为127I，积分时间为0.1秒。
实施例3的具体过程如下：10μLI-蛋白(0.01mg/mL)与10μLKI(10μg/L)、10μLKIO3(10μg/L)的标准混合液通过注射器注入到玻璃凝胶管中，分离电压为200V20min，800V100min，混合样品在柱状凝胶中实现分离，分离后进入ICP-MS进行检测。KI、KIO3与I-蛋白的标准混合溶液在120min内实现分离，电泳谱图如图9所示。
实施例3说明，该方法除可以分离检测金属蛋白外，也可应用于分离检测其他小分子化合物与非金属蛋白，如不同分子量的I-蛋白和碘化合物。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。