一种中药组合物制剂的指纹图谱的建立方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种中药组合物制剂的指纹图谱的建立方法，所述中药组合物为壮腰健肾丸。
背景技术：
：中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量检测手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。中药组合物指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。高效液相色谱法(hplc)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发性和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。2010版《中国药典》收载了中成药品种共计1069个，但是仅收载了高效液相指纹图谱9项，其中中成药仅6项。可见中成药指纹图谱的建立，绝非易事，需要解决众多的技术问题，花费大量的劳动。壮腰健肾丸，由狗脊、鸡血藤、黑老虎等九味中药材组成，具有壮腰健肾，养血，祛风湿的作用，用于肾亏腰痛，膝软无力，小便频数，遗精梦泄，风湿骨痛，神经衰弱。壮腰健肾丸收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第三册，标准编号：ws3-b-0538-91，标准中仅有显微鉴别、化学鉴别。显然，上述药品标准无法全面表征壮腰健肾丸的化学特征和质量情况。因此，有必要研究如何建立壮腰健肾丸的指纹图谱，从而更好地保证临床用 药的质量和治疗效果。技术实现要素：针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种中药组合物制剂指纹图谱的建立方法，其中所述中药组合物为壮腰健肾丸。本发明利用hplc-uv技术，建立了壮腰健肾丸指纹图谱共有模式，标定了43个共有峰，其中，确定了5个峰的化学成分归属：原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木质素。经检测，10批样品与共有模式之间相似度均大于0.9。以本发明提供的方法稳定性和重现性好，从而提供了比现有技术的检测方法更深层次和更全面的质量评价依据。为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：一种中药组合物制剂的指纹图谱建立方法，所述中药组合物以狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女贞子、鸡血藤、金樱子、牛大力、盐水制菟丝子为原料，通过本领域常用的方法，与药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂；所述指纹图谱建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述中药组合物制剂中化合物的保留时间，其中所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相由a、b和c相组成，其中a相为乙腈，b相为甲醇，c相为体积百分浓度0.05％～0.1％的磷酸水溶液，流速1ml/min，0～150min按照如下程序进行梯度：0～10min，按照体积百分比，a：b：c＝5％：0％：95％匀速地变化为a：b：c＝10％：0％：90％，10～20min，按照体积百分比，a：b：c＝10％：0％：90％，20～65min，按照体积百分比，a：b：c＝10％：0％：90％匀速地变化为a：b：c＝35％：5％：60％，65～70min，按照体积百分比，a：b：c＝35％：5％：60％匀速地变化为a：b：c＝40％：10％：50％，70～95min，按照体积百分比，a：b：c＝40％：10％：50％匀速地变化为a：b：c＝45％：15％：40％，95～130min，按照体积百分比，a：b：c＝45％：15％：40％匀速地变化为a：b：c＝80％：5％：15％，130～150min，按照体积百分比，a：b：c＝80％：5％：15％匀速地变化为a：b：c＝90％：0％：10％；柱温为20℃～40℃；紫外检测波长为210～280nm。优选的，所述c相为体积浓度0.1％的磷酸水溶液。优选的，所述柱温为30℃。优选的，所述检测波长为230nm。优选的，所述指纹图谱建立方法还包括通过以下方法制备供试品溶液：取所述中药组合物制剂5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入极性有机溶剂20～30ml，超声提取、冷浸提取或回流提取，滤过，取续滤液，即得。优选的，所述极性有机溶剂为体积浓度50％～100％的甲醇或体积浓度50％～95％的乙醇；更优选的，所述极性有机溶剂为100％甲醇。优选的，提取方式为超声提取，提取时间40～50min。更优选的，通过如下方法制备所述供试品溶液：取所述中药组合物制剂5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。优选的，所述指纹图谱建立方法还包括通过如下方法制备对照品溶液：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸120μg/ml、原儿茶醛130μg/ml、特女贞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木质素30μg/ml的混合对照品溶液，即得。作为一个优选的实施方式，本发明提供所述中药组合物制剂的指纹图谱建立方法，具体的操作步骤包括：1)对照品溶液的制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸120μg/ml、原儿茶醛130μg/ml、特女贞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木质素30μg/ml的混合对照品溶液，即得；2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物制剂5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声45min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录150min内的色谱图，得到指 纹图谱：色谱柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色谱柱(规格：250×4.6mm，5μm)；流动相：由a、b和c相组成，其中a相为乙腈，b相为甲醇，c相为体积百分浓度0.05％～0.1％的磷酸水溶液，流速1ml/min，0～150min按照如下程序进行梯度：0～10min，按照体积百分比，a：b：c＝5％：0％：95％匀速地变化为a：b：c＝10％：0％：90％，10～20min，按照体积百分比，a：b：c＝10％：0％：90％，20～65min，按照体积百分比，a：b：c＝10％：0％：90％匀速地变化为a：b：c＝35％：5％：60％，65～70min，按照体积百分比，a：b：c＝35％：5％：60％匀速地变化为a：b：c＝40％：10％：50％，70～95min，按照体积百分比，a：b：c＝40％：10％：50％匀速地变化为a：b：c＝45％：15％：40％，95～130min，按照体积百分比，a：b：c＝45％：15％：40％匀速地变化为a：b：c＝80％：5％：15％，130～150min，按照体积百分比，a：b：c＝80％：5％：15％匀速地变化为a：b：c＝90％：0％：10％；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；紫外检测波长：230nm；4)共有峰的标定：以原儿茶酸吸收峰为参照峰，共有峰包括原儿茶醛吸收峰、特女贞苷吸收峰、日本南五味子素甲或(2′s)-南五味子木质素吸收峰中的一个或多个，相对保留时间为：原儿茶醛吸收峰：1.384±0.04％，特女贞苷吸收峰：3.729±0.07％，日本南五味子素甲吸收峰：7.854±0.06％，(2′s)-南五味子木质素吸收峰：10.305±0.06％。优选的，上述指纹图谱建立方法中，所述的中药组合物制剂的原料由如下重量份的药材组成：狗脊1876重量份，黑老虎1125重量份，千斤拔450重量份，蒸桑寄生563重量份，蒸女贞子94重量份，鸡血藤1125重量份，金樱子600重量份，牛大力750重量份，盐水制菟丝子94重量份。还优选的，所述中药组合物为丸剂。更优选的，所述中药组合物为壮腰健肾丸，通过如下方法制备：1)准备如下重量份的药材：狗脊1876重量份，黑老虎1125重量份，千斤拔450重量份，蒸桑寄生563重量份，蒸女贞子94重量份，鸡血藤1125重量份，金樱子600重量份，牛大力750重量份，盐水制菟丝子94重量份；2)狗脊876重量份和黑老虎的木部、以及全部重量份的鸡血藤、金樱子、千斤拔和牛大力加水煎煮二次，第一次4小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；狗脊1000重量份、黑老虎的皮部和全部重量份的蒸桑寄生、蒸女贞子和盐水制菟丝子共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末用炼蜜50～60g与适量的水泛丸，以药用活性炭包衣，干燥，抛光，制成浓缩水蜜丸，即得。上述丸剂按照本发明所述指纹图谱建立方法建立的指纹图谱，包括43个特征峰，以原儿茶酸吸收峰为参照，所述特征峰的相对保留时间和相对峰面积分别为：峰1：相对保留时间0.341±0.19％，相对峰面积0.1628±21.25％；峰2：相对保留时间0.565±0.1％，相对峰面积1.0443±20.51％；峰3：相对保留时间0.719±0.14％，相对峰面积0.0912±36.29％；峰4：相对保留时间0.750±0.08％，相对峰面积0.1571±40.04％；峰5：相对保留时间0.841±0.09％，相对峰面积0.1776±25.56％；峰6：相对保留时间1，相对峰面积1；峰7：相对保留时间1.167±0.07％，相对峰面积0.1055±13.84％；峰8：相对保留时间1.278±0.06％，相对峰面积0.1386±16.88％；峰9：相对保留时间1.384±0.04％，相对峰面积0.5889±9.37％；峰10：相对保留时间1.895±0.1％，相对峰面积0.1271±23.68％；峰11：相对保留时间2.145±0.08％，相对峰面积0.0824±22.33％；峰12：相对保留时间2.920±0.08％，相对峰面积0.0636±18.71％；峰13：相对保留时间3.382±0.04％，相对峰面积0.098±42.96％；峰14：相对保留时间3.458±0.03％，相对峰面积0.8493±41.7％；峰15：相对保留时间3.729±0.07％，相对峰面积0.7333±15.64％；峰16：相对保留时间3.933±0.03％，相对峰面积0.1746±38.14％；峰17：相对保留时间3.997±0.05％，相对峰面积0.2380±30.55％；峰18：相对保留时间4.285±0.05％，相对峰面积0.2705±37.45％；峰19：相对保留时间4.677±0.04％，相对峰面积0.3391±37.86％；峰20：相对保留时间4.735±0.04％，相对峰面积0.3952±75.3％；峰21：相对保留时间4.835±0.04％，相对峰面积0.1043±44.77％；峰22：相对保留时间5.016±0.04％，相对峰面积0.4085±62.55％；峰23：相对保留时间5.269±0.04％，相对峰面积0.3366±81.79％；峰24：相对保留时间6.461±0.04％，相对峰面积0.1103±22.39％；峰25：相对保留时间7.575±0.07％，相对峰面积0.9041±29.95％；峰26：相对保留时间7.854±0.06％，相对峰面积0.909±24.99％；峰27：相对保留时间8.155±0.07％，相对峰面积0.6081±15.7％；峰28：相对保留时间8.264±0.07％，相对峰面积0.2334±47.51％；峰29：相对保留时间8.389±0.09％，相对峰面积0.4306±58.1％；峰30：相对保留时间9.646±0.05％，相对峰面积0.3649±21.13％；峰31：相对保留时间9.787±0.07％，相对峰面积0.1107±26.47％；峰32：相对保留时间9.862±0.06％，相对峰面积0.1695±17.05％；峰33：相对保留时间9.987±0.06％，相对峰面积0.6084±21.68％；峰34：相对保留时间10.099±0.06％，相对峰面积0.581±21.96％；峰35：相对保留时间10.176±0.06％，相对峰面积0.8761±27.34％；峰36：相对保留时间10.305±0.06％，相对峰面积1.304±18.95％；峰37：相对保留时间11.325±0.04％，相对峰面积0.6154±20.77％；峰38：相对保留时间11.393±0.05％，相对峰面积0.1246±33.31％；峰39：相对保留时间11.758±0.05％，相对峰面积0.5035±23.77％；峰40：相对保留时间11.899±0.06％，相对峰面积0.1423±16.51％；峰41：相对保留时间12.007±0.06％，相对峰面积0.2552±30.64％；峰42：相对保留时间12.171±0.07％，相对峰面积0.1463±30.08％；峰43：相对保留时间12.256±0.06％，相对峰面积0.2524±30.03％。从化学成分的比对来看，其中峰6是原儿茶酸吸收峰，峰9是原儿茶醛吸收峰，峰15是特女贞苷吸收峰，峰26是日本南五味子素甲吸收峰，峰36是(2′s)-南五味子木质素吸收峰。本发明的另一目的在于提供上述指纹图谱建立方法在一种中药组合物制剂的真伪鉴别和成分检测中的应用；所述中药组合物的原料组成为狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女贞子、鸡血藤、金樱子、牛大力、盐水制菟丝子。优选的，所述中药组合物制剂为壮腰健肾丸。本发明还有一个目的在于提供一种检测原料组成为狗脊、黑老虎、千 斤拔、蒸桑寄生、蒸女贞子、鸡血藤、金樱子、牛大力、盐水制菟丝子的中药组合物的成分的方法，包括采用上述指纹图谱建立方法建立的指纹图谱。优选的，所述中药组合物制剂为壮腰健肾丸。本发明提供的指纹图谱建立方法，以高效液相色谱和紫外光谱联用为分离和鉴别手段，得到的指纹图谱具有系统性、特征性和稳定性，具体体现在：1.系统性：所述中药组合物制剂，优选为壮腰健肾丸，原料组成为狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女贞子、鸡血藤、金樱子、牛大力、盐水制菟丝子，在指纹图谱中，体现了原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、(2′s)-南五味子木质素等指标性成分。2.特征性：采用本发明所述方法建立的指纹图谱，是基于本发明所述中药组合物制剂的特定的原料药以及在制剂过程中化学成分间的相互作用，以原儿茶酸吸收峰为参照，各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积在一定范围内是相对稳定，并且会在药味组成发生变化(比如使用伪劣药材或者投料量不足)时产生差异。据此，可以很好地鉴别真伪，控制质量，减少了人为处理产品使检测结果为假阳性的可能性。另外，本发明所述方法建立的所述中药组合物制剂(优选为壮腰健肾丸)的指纹图谱，特征峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高(与对照图谱的相似度均大于0.9)，准确可靠。3.稳定性：本发明所述方法对供试品溶液的制备、色谱条件、测定过程、数据采集、处理、分析等都做了详细限定，从而保证不同操作者、不同实验室重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内，体现了所述方法的通用性、实用性和重现性。特别的，以本发明所述方法建立的所述壮腰健肾丸的指纹图谱中，10批样品的所有共有峰相对保留时间的rsd＜0.2％。本发明提供的方法建立的壮腰健肾丸的指纹图谱，能有效地表征本发明所述中药组合物制剂，有利于全面监控产品的质量，更好地保障患者用药安全和治疗效果。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1为实施例1中考察提取溶剂试验的色谱图，其中s1是甲醇为提取溶剂的色谱图，s2是75％甲醇为提取溶剂的色谱图，s3是50％甲醇为提取 溶剂的色谱图，s4是95％乙醇为提取溶剂的色谱图，s5是50％乙醇为提取溶剂的色谱图。图2为实施例2中考察流动相试验的色谱图，其中，s1是乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相的色谱图，s2是乙腈-甲醇-水为流动相的色谱图，s3是乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相的色谱图，s4是甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相的色谱图。图3为实施例5中生成的对照指纹图谱，图中的标号1-43为共有色谱峰的标号。图4为实施例5中10批样品匹配后的色谱图，其中s1-s10为样品的编号。图5为实施例5中对照品溶液的hplc色谱图。图中的标号为与对照指纹图谱色谱峰相对应峰的标号。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：1.仪器agilent1200型高效液相色谱仪；色谱柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色谱柱(250×4.6mm,5μm)；sb-5200dtd超声波处理器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；sartorious电子分析天平。2.试剂乙腈、甲醇(色谱级，merck公司)；磷酸(色谱级，科密欧)；乙醇、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯(分析纯，广州化学试剂厂)；水(millipore超纯水)。3.样品、对照药材与标准品3.1样品壮腰健肾丸(水蜜丸)，批号c08047(s1)，fk3291(s2)，ek3341(s3)，c08182(s4)，em3381(s5)，ej3001(s6)，c08183(s7)，fu4901(s8)， d05125(s9)，em3581(s10)；均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供；制备工艺为：1)按照如下处方准备各味药材：狗脊1876g，黑老虎1125g，千斤拔450g，蒸桑寄生563g，蒸女贞子94g，鸡血藤1125g，金樱子600g，牛大力750g，盐水制菟丝子94g；2)狗脊876g和黑老虎的木部、以及全部的鸡血藤、金樱子、千斤拔和牛大力加水煎煮二次，第一次4小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；剩余的狗脊1000g、黑老虎的皮部和全部的蒸桑寄生、蒸女贞子和盐水制菟丝子共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末用炼蜜50～60g与适量的水泛丸，以药用活性炭包衣，干燥，抛光，制成浓缩水蜜丸。3.2对照品原儿茶酸、原儿茶醛对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：110809-200503,110810-200205，特女贞苷对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为：111926-201102；日本南五味子素甲、(2′s)-南五味子木质素均为自制(纯度＞95％，经中国科学院华南植物园结构鉴定)。实施例1供试品溶液制备方法的建立1.1提取溶剂的选择：取批号c08047的壮腰健肾丸样品5g，研细，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，分别精密加入25ml甲醇、75％甲醇(体积百分浓度)、50％甲醇(体积百分浓度)、95％乙醇(体积百分浓度)、50％乙醇(体积百分浓度)，超声45min后，放冷至室温，称定重量，分别用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在下述色谱条件下，分别测定不同提取溶剂制备得到的供试品溶液，记录0～150min的色谱图：色谱柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色谱柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(a)-甲醇(b)-0.1％磷酸水(c)，梯度洗脱条件见表1；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；紫外检测波长：230nm；进样量：10μl。表1梯度洗脱程序结果见图1。图谱显示用甲醇提取时，峰的数目最多，且基线平稳。说明甲醇为提取溶剂，样品中成分提取较完全，故选择甲醇为提取溶剂。1.2提取方法的比较取批号c08047的样品约5g。研细，精密称定，以25ml甲醇为提取溶剂，分别采取超声30min、45min、1h、回流1h及冷浸过夜五种提取方法制备供试品。依照“1.1提取溶剂的选择”项下所述的色谱条件测定，记录0～150min的色谱图。结果表明，五种提取方法中，以超声45min、1h以及回流1h得到的图谱峰数量为多，且三者无明显差别(色谱图略)，故选择最简单易行的超声45min为提取方法。通过本实施例优选出了供试品溶液的制备方法，具体操作为：取所述中药组合物制剂5g，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声45min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实施例2色谱条件的建立2.1流动相的确定按照实施例1优选出的供试品溶液的制备方法，取批号c08047的样品约5g制备供试品溶液。柱温30℃，进样量10μl，流速：1ml/min，检测波长230nm，分别以甲醇(a+b)-0.1％磷酸水溶液(c)、乙腈(a+b)-0.1％磷酸水溶液(c)，乙腈(a)-甲醇(b)-水(c)及乙腈(a)-甲醇(b)-0.1％磷酸水溶液(c)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表1。洗脱时长150min，记录色谱图。色谱图见图2。结果显示：乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相，基线相对平稳且分离效果最好。因此选择乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相，按照表1所示的 程序进行洗脱。2.2色谱柱的考察研究发现，即使是同种规格的c18色谱柱，同一化合物在不同商家的产品中的出峰时间及峰形是有差异的。经过对比phenomenexluna色谱柱，agilenteclipsexdbc18色谱柱，watersatlantis色谱柱，结果表明，phenomenexluna色谱柱的分离效果最好。(色谱图略)2.3检测波长的考察按照实施例1优选出的供试品溶液的制备方法，取批号c08047的样品约5g制备供试品溶液。采用phenomenexluna5uc18(2)100a色谱柱(250×4.6mm,5μm)，乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱程序见表1，柱温30℃，进样量10μl，流速：1ml/min。采用dad检测器进行全波长扫描。经波长扫描可以发现：230n下色谱图峰的数目最多，峰形较好且基线相对较平稳。故选择230nm为检测波长。实施例3壮腰健肾丸的成分检测1.色谱柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色谱柱(250×4.6mm,5μm)；2.流动相：乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱程序见表1；3.流速：1.0ml/分钟；4.检测波长：230nm；5.柱温：30℃；6.供试品溶液的制备：按照实施例1优选出的方法制备；7.对照品溶液的制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸120μg/ml、原儿茶醛130μg/ml、特女贞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木质素30μg/ml的混合对照品溶液，即得；8.测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录150min的色谱图；9.共有峰的标定：根据对照品色谱图对供试品色谱的相应吸收峰进行归属，确定以原儿茶酸吸收峰为参照峰，标定各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。实施例4方法学验证4.1仪器精密度取壮腰健肾丸(批号c08047)，按照实施例3的方法制备供试品溶液，连续进样6次，测定并记录0～150min的色谱图。图谱中，以原儿茶酸(6号峰)为参考峰，分别对各共有峰保留时间和相对峰面积的变化情况进行考察。结果显示在测定时间内，共有43个吸收峰。各共有峰保留时间rsd均小于0.14％，相对峰面积rsd小于4.19％，表明实验仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。其中相对峰面积考察结果见表2。表2精密度相对峰面积考察结果4.2方法重现性取壮腰健肾丸(批号c08047)，按照实施例3所述方法平行制备6份供试品溶液，按照实施例3的方法测定。以原儿茶酸吸收峰为参照峰，考察其他各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，计算rsd值。43个共有峰的相对保留时间rsd均低于0.16％，相对峰面积rsd均小于5.02％，表明方法重现性良好。其中相对峰面积的结果见表3。表3重复性考察结果(相对峰面积)4.3稳定性考察取壮腰健肾丸(批号c08047)，按照实施例3的方法制备供试品溶液，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h，按照实施例3的方法进行测定。记录0～150min的色谱图，以原儿茶酸为参照，考察其他各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，计算rsd。结果表明，24h内测定，43个峰的相对保留时间rsd均低于0.24％，相 对峰面积rsd均小于4.5％。相对峰面积考察数据见表4。说明在测定时间内，供试品溶液稳定。表4稳定性考察结果(相对峰面积)通过本实施例的试验表明，本发明建立的测定方法稳定、重现性好。实施例5壮腰健肾丸指纹图谱的建立5.1壮腰健肾丸指纹图谱的建立参照实施例3的方法，检测并记录了10批壮腰健肾丸(s1-s10)0～150min的色谱图。以s1(批号：c08047)样品图谱为参照图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004a版)软件对上述10批壮腰健肾丸hplc指纹图谱进行数据分析，生成了10批样品的共有模式，见图3，为对照指纹图谱。经匹配后的图谱见图4。10批样品hplc指纹图谱43个共有峰的相对保留时间rsd均低于0.19％。相对峰面积考察数据见表5。表510批壮腰健肾丸相对峰面积5.2相似度评价将所述10批次样品的色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，结果见表6。表610批次样品与其对照指纹图谱间的相似度值s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10对照s110.8650.960.9980.9180.9460.9950.9690.9110.9560.978s20.86510.930.8570.9060.9620.8530.9120.9110.8640.937s30.960.9310.9510.9560.9850.9480.9360.9520.9770.989s40.9980.8570.95110.9110.9380.9970.9720.9060.9460.974s50.9180.9060.9560.91110.9680.9130.90.9970.9190.969s60.9460.9620.9850.9380.96810.9360.9440.9670.9460.99s70.9950.8530.9480.9970.9130.93610.9690.9080.9450.972s80.9690.9120.9360.9720.90.9440.96910.8980.8970.967s90.9110.9110.9520.9060.9970.9670.9080.89810.9140.967s100.9560.8640.9770.9460.9190.9460.9450.8970.91410.963对照0.9780.9370.9890.9740.9690.990.9720.9670.9670.9631表6数据显示，所述10批次样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，未发现离群样本，表明10个批次样品的质量稳定性良好，符合国家食品药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。5.3hplc指纹图谱峰归属按照实施例3所述的方法制备对照品溶液并进行测定，记录0～150min的hplc色谱图，见图5。根据对照品hplc色谱图保留时间对壮腰健肾丸指纹图谱中的色谱峰进行归属，其中6号为原儿茶酸色谱峰，9号为原儿茶醛色谱峰，15号为特女贞苷色谱峰，26号为日本南五味子素甲色谱峰，36号为(2′s)-南五味子木质素色谱峰。通过以上研究，本发明建立了壮腰健肾丸的高效液相指纹图谱。通过对多批次样品的测定证明该方法重现性、专属性等良好，色谱体现了原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素、(2′s)-南五味子木质素为指标的主要特征，可以提供比常规质量标准更深层次的质量评价依据。以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。当前第1页12