一种数字化单分子电化学检测碱性磷酸酶的方法与流程

本发明涉及一种数字化单分子电化学检测碱性磷酸酶的方法，属于分析检测领域。

背景技术：

随着科学技术的发展，人们对生命和自然的探索已经深入到单细胞、单分子水平，给常规的分析方法带来了极大的挑战。传统实验都是以分子聚集体为目标，得到的是物质的平均行为，往往掩盖了许多重要信息。准确、灵敏地检测单个分子，特别是DNA和蛋白质等生物分子，在生物学和临床医学中可以带来新的突破。此外，单分子检测可揭示分子的异质性、分子间相互作用及单个分子的物理化学特性。显微术、光学和电学是单分子检测中三种主要的方法。

目前，单分子电化学(SEM)已经取得了较大的进展，主要分为两类：(1)检测单个电活性分子连续氧化还原循环后产生的电流。例如，利用单个二茂铁分子在超微尖端电极和基底电极间的氧化还原循环实现单分子检测。虽然该方法可直接检测电信号，无需信号转换，但是布朗运动的不确定性、两个纳米间隙工作电极制备的困难及多个氧化还原循环的要求限制了其在生化中的应用。(2)调控单个分子的氧化还原状态，结合荧光技术。例如，利用分子在氧化态具有强荧光信号，而在还原态几乎无荧光实现单分子检测。通过光谱电化学，单个氧化还原事件就可以实现高灵敏检测，但是只有部分氧化还原分子具有可变的荧光强度。总的来说，这些方法主要是从概念、方法学上探究SME，SME的可靠性问题是其实际应用中一个挑战。目前，许多利用纳米颗粒和酶的放大来提高方法的灵敏度，可达aM水平，为单分子检测提供了可能。但是，可靠、准确的定量方法的缺乏阻碍了SEM在复杂体系中的应用。

在这里，我们提出了一种数字化单分子电化学检测(dSMED)碱性磷酸酶的方法。与酶产物直接氧化信号相比，酶促金属化可将信号提升约100倍，提供了一种高效信号放大策略，为单分子电化学检测提供了可能。在数字化分析中，输出信号读出为“0”或“1”，不再考虑具体信号强度，其中“0”代表无目标物分子，而“1”代表有目标物分子。基于泊松分布公式，目标物浓度可简单地通过“0”的概率计算得到。可有效地避免单个分子的信号波动带来的影响，适合于生物体系中小概率事件的检测，提高了SME在实际应用中的可靠性和准确性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可靠、灵敏、准确的数字化单分子电化学检测碱性磷酸酶的方法。

本发明所提供的技术方案具体如下：

一种数字化单分子电化学检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：

(1)以ITO玻片作为基底，以设计有n个微电极条带的菲林胶片作为掩膜，进行软光刻，洗去曝光区的光刻胶后，用浓盐酸浸泡后洗去光刻胶以外的ITO膜；然后洗去光刻胶，再用piranha溶液浸泡，最后将ITO玻片置于氯金酸溶液中，利用电沉积法在ITO玻片上修饰纳米金颗粒，得到含n个纳米金条带的ITO玻片；其中，n≥10；

(2)在PDMS上打n×m个通孔，将通孔行列与纳米金条带对齐，利用等离子体键合法将PDMS键合到含n个纳米金条带的ITO玻片表面，得到纳米金微电极阵列；其中，m≥10；

(3)用pH＝9.8的二乙醇胺溶液将碱性磷酸酶溶液稀释，然后加入含对氨基磷酸酚和AgNO₃的溶液，混合均匀，得到预混反应液；

(4)向纳米金微电极阵列的每个小孔中滴加等体积的预混反应液，37℃下反应30min后，用超纯水洗去小孔中多余的银离子及对氨基磷酸酚，然后向每个小孔中加入KCl溶液，以Ag/AgCl丝作为对电极和参比电极，进行线性伏安扫描，记录银的溶出伏安信号；当小孔中不含碱性磷酸酶时，电信号读出为0；当小孔中至少含一个碱性磷酸酶分子时，电信号读出为1；

(5)将电信号通过MATLAB程序转换成多色球，通过统计暗球和亮球的个数计算0或1的概率，然后通过泊松分布公式计算预混反应液中碱性磷酸酶的浓度。

优选地：

软光刻所使用的光刻胶为AZ4620光刻胶。

所述的piranha溶液为体积比7:3的浓硫酸/双氧水混合液。

步骤(1)利用电沉积法在ITO玻片上修饰纳米金颗粒的方式为：将ITO玻片置于氯金酸溶液中，以Ag/AgCl为电极，在恒电位-0.1V下静置20秒。

n＝10,m＝50。

二乙醇胺溶液的浓度为0.5M；预混反应液中碱性磷酸酶的浓度为1-50aM。

步骤(5)线性伏安扫描的条件为：电势扫描范围为-0.1V～0.2V，扫描速率为100mV/s。

纳米金微电极阵列中每个纳米金条带的宽度为100μm，相邻两个纳米金条带间距为3mm。

PDMS上通孔的直径为1mm。

本发明的原理具体为：单个碱性磷酸酶(ALP)催化其底物对氨基磷酸酚(p-APP)产生还原性的对氨基苯酚(p-AP)，p-AP可立即将Ag⁺还原成Ag⁰沉积到微电极表面，最后通过金属溶出伏安法得到电信号。本发明利用软光刻技术构建了10×10彼此独立的金微电极阵列，用于数字化分析的高通量平行实验。通过稀释酶浓度和控制反应液体积，保证每个微电极中至多含有单个酶分子，从而实现碱性磷酸酶的单分子检测。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明将数字化分析与单分子电化学(SME)相结合，有效地提高了方法的可靠性和准确性。

(2)与酶产物直接氧化信号相比，酶促金属化可将信号增强约100倍，增强了信噪比，利于单分子电化学检测。

(3)基于数字化分析，电信号被读出为“0”或“1”，不用考虑具体的电流强度，有效地解决了SME的电流波动和可靠性问题，ALP检出限从50aM降到1aM，并成功用于复杂体系肝癌细胞中ALP的检测。

附图说明

图1(A)为单分子电化学检测碱性磷酸酶示意图；图1(B)为不同酶浓度下的电流强度：(a)酶促金属化；(b)酶产物直接氧化；图1(C)为不同酶浓度下金属溶出伏安信号(0.05,0.2,0.5,0.7,1fM)。

图2(A)为不同溶液组成下的电流溶出曲线：(a)ALP+p-APP；(b)AgNO₃+ALP；(c)AgNO₃+p-APP；(d)AgNO₃+p-APP+ALP；图2(B)表示不同ALP浓度下的电流强度(0.001,0.01,0.02,0.05,0.1,0.15,0.2fM)。

图3(A)为金微电极的扫描电镜图；图3(B)为[Fe(CN)₆]^3-/4-在微电极表面的循环伏安图；图3(C)不同酶浓度下电流强度：(a)有纳米金；(b)无纳米金修饰的微电极阵列。

图4(A)微电极阵列及电信号读出为“0”或“1”示意图；图4(B-1)、图4(B-2)、图4(B-3)分别为1、5、10aM酶浓度下500个微电极的电流分布；图4(C-1)、图4(C-2)、图4(C-3)分别为1、5、10aM酶浓度下实验统计和泊松分布理论计算得到的概率分布(0,1,2,3个酶分子)比较图；图4(D-1)、图4(D-2)、图4(D-3)分别为1、5、10aM酶浓度下500个电信号通过MATLAB程序转换为不同颜色的球。

图5(A)为电信号与Ag⁺浓度的线性曲线；图5(B)为Ag⁰量、电流强度随沉积时间的变化曲线；图5(C)为酶催化反应的初始速度倒数与Ag⁺浓度倒数的线性曲线；图5(D)为不同的单酶分子的电流时间曲线。

图6(A)为每个微电极中平均酶分子数(AEM)与初始加入酶浓度的关系曲线(插图为其相应线性曲线)；图6(B)为碱性磷酸酶检测的特异性柱状图。

图7(A)为肝癌细胞中碱性磷酸酶检测示意图；图7(B-1)、图7(B-2)分别为Hep G2和MCF-7细胞的500个电信号通过MATLAB程序转换为不同颜色的球；图7(C)为肝癌细胞中碱性磷酸酶检测的特异性柱状图。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。下面以碱性磷酸酶为例，对基于数字化单分子电化学检测酶的方法进行详细的说明。

实施例1

1、微电极阵列的制备

我们结合软光刻的微加工方法制作了微电极阵列。采用ITO玻片作为基底，将其置于匀胶机上，旋涂AZ4620光刻胶(前转600rpm，15s；后转2000rpm，30s)，将ITO玻片置于75℃的烘台上烘烤3min，然后置于105℃的烘台上烘烤5min。待ITO玻片冷却后采用设计有n个微电极条带的微电极阵列图案的菲林胶片作为掩膜，于17.4mw/cm²的紫外曝光强度下曝光40s，随后采用显影液(AZ400K:H₂O＝1：3)对ITO玻片进行显影，至曝光区光刻胶刚好去除干净后采用超纯水冲洗。然后将ITO玻片置于浓盐酸中浸泡，洗掉ITO玻片上除光刻胶外其他部分的ITO膜，得到含10个100μm宽ITO条带的微电极阵列，其中，每两个相邻ITO条带的间距约为3mm，用超纯水冲洗，氮气吹干备用。

将PDMS(交联剂B与单体A质量之比为1:10)浇注到硅片上，室温下放置30min，待气泡消除后置于75℃烘箱内加热2h进行固化，切出PDMS块，采用直径为1mm的打孔器在每小块PDMS上打100个通孔(10×10，与微电极阵列相对应)备用。

用无水乙醇将上述ITO玻片表面剩余的光刻胶完全洗去，并用piranha溶液((V(浓硫酸)：V(双氧水)＝7:3))浸泡2min。将ITO玻片置于氯金酸溶液中，恒电位-0.1V(vs.Ag/AgCl)下静置20秒，采用电沉积方法在ITO玻片上修饰纳米金颗粒，得到含10个纳米金条带(带宽均为100μm)的ITO玻片。最后将有100个孔的PDMS块通过等离子体键合到含10个纳米金条带的ITO玻片表面，通孔与纳米金条带位置对齐，得到10×10彼此独立的纳米金微电极阵列。

2、单个碱性磷酸酶分子的检测

先用pH 9.8 0.5M二乙醇胺溶液将ALP稀释到20aM，然后与含1mM p-APP、100μM AgNO₃的溶液混合，得到预混反应液；分别取出0.5μL预混反应液滴加到纳米金微电极阵列的每个小孔内。通过控制预混反应液中ALP浓度和每个小孔内的加入体积，控制每个小孔内约含有单个酶分子。37℃下反应30min后，用超纯水洗去小孔内多余的银离子及底物后，加入0.5M KCl溶液5μL，以Ag/AgCl丝作为对电极和参比电极，在-0.1V到0.2V范围内，100mV/s进行线性伏安扫描(LSV)，得到银的溶出伏安信号。每5个微电极阵列(共500个微电极，也可用10×50的微电极阵列)进行一次平行实验，分别记录不同酶浓度下500个微电极的电流分布，并且将实验得到的微电极的概率分布(含0、1、2或多个酶分子)与泊松分布理论计算结果比较，来证实数字化单分子酶检测的可靠性和准确性。

为了考察酶促金属化的放大效率，分别取不同酶浓度的5μL二乙醇胺溶液(含有1mM p-APP)于微电极阵列表面，置于37℃下反应30min后，通过LSV得到ALP的催化产物p-AP在电极表面的氧化信号，将p-AP的氧化信号与酶促金属化的银溶出信号进行比较。

3、肝癌细胞内碱性磷酸酶的高灵敏检测

首先收集约10000个肝癌细胞于试管中，用超声仪将细胞破碎后，10000rpm下离心10min，取上清液，用二乙醇胺适当稀释后，分别取0.5μL上清液(含有1mM p-APP，100μM AgNO₃)于500个微电极表面进行酶促金属化反应。37℃下反应30min后，500个微电极电信号读出为“0”(不含酶分子)或“1”(至少含一个酶分子)。基于泊松分布和数字化分析，肝癌细胞内ALP浓度可通过读出为“0”的概率计算得到。

结果分析：

1、数字化放大的单分子检测

目前，单分子检测取得了较大进展，但要检测到单个分子的极少量电荷是很困难的。需要高效的信号放大策略去提高单位时间内电子转移数(1.6fA≈10⁴个电子每秒)。这里，数字化(EIM)的高效信号放大策略，实现了单个碱性磷酸酶分子检测，如图1(A)。ALP催化其底物对氨基磷酸酚(p-APP)产生还原性的对氨基苯酚(p-AP)，p-AP可立即将Ag⁺还原成Ag⁰沉积到微电极表面。原因是p-AP和Ag⁺的半波电位(versus NHE)分别是0.097V和0.799V，通过合适的沉积时间，大量的Ag⁰沉积到电极表面，最后在KCl溶液中通过线性扫描伏安法(LSV)得到银溶出信号。与酶产物p-AP的直接氧化信号相比，EIM可将信号增强约100倍，如图1(B)。其主要原因为：(1)EIM和LSV的结合可双重放大电信号，提高信噪比；(2)ALP可快速催化底物分子的反应，及相应的银沉积过程；(3)EIM可有效抑制底物从电极表面的扩散，富集大量Ag⁰在电极表面；(4)修饰了纳米金的微电极阵列可提高EIM反应，并且纳米金颗粒可作为银沉积的种子，避免银沉积对酶活性的影响。如图1(C)，当ALP浓度低至0.05fM时，仍可测得稳定的电流信号，为单分子电化学检测提供了可能。

在单分子电化学中，背景是必须要考虑的问题。如图2(A)，在ALP与p-APP(a)，AgNO₃与ALP(b)，或AgNO₃与p-APP(c)存在下，几乎无电流信号，表明p-APP或ALP单独存在下不会将Ag⁺还原成Ag⁰。只有当AgNO₃、ALP和p-APP同时存在时，才得到很强的溶出信号，且明显高于背景信号，表明了单分子电化学检测ALP的可行性和特异性。

然而，当ALP浓度稀释到单分子水平时，每个微电极内多一个或少一个酶分子，会给酶的放大效率以及电信号带来较大影响。此外，酶分子间的异质性进一步影响电流的稳定性，限制了单分子电化学在实际应用中的准确性和可靠性。如图2(B)，当ALP浓度低于0.05fM时，电流的变化出现大的波动，并且只有一部分微电极得到可测的电流信号。

2、微电极阵列的特性

归因于微电极的尺寸小、背景低、灵敏度高、响应快、时空分辨率高等优势，已经广泛用于单细胞和单分子检测中。在这里，为了实现数字化单分子分析中高通量平行实验，通过软光刻技术构建了一种10×10彼此独立的、活性均匀的微电极阵列。因为金可以诱导银沉积，采用金微电极作为检测电极进行银沉积，不仅能加速银的还原反应，而且有利于银沉积到检测电极表面进行溶出伏安分析。利用简单的电沉积，于氯金酸溶液中在ITO玻片表面制备了修饰了纳米金的微电极阵列。由其扫描电镜(SEM)图可清楚地看到玻片表面成功修饰的金纳米颗粒(图3(A))。于0.5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中的循环伏安如图3(B)，可见微电极间的电活性比较均一，适用于高通量平行实验。此外，与未修饰纳米金的ITO微电极比，修饰了纳米金的微电极可将电信号增强约3倍(图3(C))，利于单分子酶电化学检测。

3、结合数字化分析提高单分子电化学的可靠性

数字化分析的结合可有效地解决单分子电化学的电流波动和可靠性问题，由于电信号被读出为“0”(不含酶分子)或“1”(至少含一个酶分子)，不再考虑电流的具体强度，并且目标物浓度可通过“0”的概率计算得到，如图4(A)。无酶时，通过500个微电极的电信号分布，测得背景电流约2nA。低ALP浓度下，为了避免电流波动造成的影响，电信号被读出为“0”或“1”。将稀释的酶溶液随机加入微电极中，每个微电极中会随机分布0、1、2或多个酶分子，而其相应概率可由泊松分布公式：计算得到，其中x代表分子数，λ表示每个微电极中平均酶分子数。当酶浓度为1、5和10aM时，λ分别为0.05、0.25和0.5。例如，当λ＝1时，含0或1个酶分子概率为e^-1＝0.368；含2个酶分子概率为e^-1/2＝0.184；含3个酶分子概率为e^-1/6＝0.08。

绘制不同酶浓度下500个微电极的电流分布，如图4(B-1)-图4(B-3)，每个酶浓度下都出现了很大的电流波动。但是含1、2或多个酶分子的概率随着酶浓度增加而增加。因此，500个微电极可由其电信号为1.8±1.0、8.0±1.0、11.7±1.5和15.8±1.5nA划分为四部分，分别含0、1、2和多个酶分子。其中1.8nA代表背景电流，8nA表示单个酶分子的电信号。如图4(C-1)-图4(C-3)，实验统计得到的酶分布情况与泊松分布理论计算结果吻合较好，表明数字化分析单分子电化学检测ALP的可靠性和准确性。为了简化统计过程，500个电信号通过MATLAB程序转换成多色球，如图4(D-1)-图4(D-3)，可简单的通过统计暗球和亮球个数来计算“0”或“1”的概率。

4、单个碱性磷酸酶分子的动力学表征

首先，足够的ALP、p-APP和沉积时间保证Ag⁺充分还原成Ag⁰，从而绘制了Ag⁺浓度与电信号的线性曲线，如图5(A)。单分子酶条件下，电信号随着沉积时间增加而增加，且电极表面Ag⁰沉积量可通过图5(A)中标准曲线计算得到。如图5(B)，Ag⁰沉积量与电流随沉积时间变化吻合较好，表明电信号是来自于酶促金属化和金属的溶出伏安信号，而非背景信号。此外，如图5(C)，绘制了反应速度的倒数与Ag⁺浓度倒数的线性曲线，由Lineweaver-Burk方程：单个ALP的米氏常数(Km)计算得0.169mM，与常规实验的0.15mM具有可比性，表明单个酶分子仍对底物具有强的催化活性。最后，通过不同酶分子随沉积时间的电流变化情况，证实了单个酶分子间的异质性，如图5(D)。

5、数字化单分子电化学检测碱性磷酸酶

当x＝0时，公式(1)可变形为：λ₀＝-lnP_x＝0(3)。进而，酶浓度可由公式：计算得到，其中N_A表示阿伏伽德罗常数(6.02×10²³mol^-1)，V表示反应液体积。如图6(A)，每个微电极中平均酶分子数(AEM)随加入的酶浓度的增加而增加，且由其插图可知，从1aM到20aM的酶浓度下可得到好的线性曲线，且检出限低至1aM，可认为是ALP检测中最灵敏的方法。因此，通过数字化分析的结合，ALP检出限从50aM降低到1aM，提高了单分子电化学在实际应用中的灵敏度和可靠性。

图6(B)是用10pM葡萄糖、10pM尿素、20fM抗坏血酸及15fM凝血酶作为对照组所得到的微电极中酶分子数柱状图。从图中可以看出实验组(含20aM ALP)明显高于对照组，且当干扰物浓度高于目标物3-6个数量级时，实验组结果是对照组的20倍，证明该方法具有比较好的特异性。

6、肝癌细胞内碱性磷酸酶检测

通过复杂体系中ALP的高灵敏检测进一步讨论数字化单分子电化学检测的可靠性和灵敏度。利用细胞破碎仪从裂解的肝癌细胞Hep G2和乳腺癌细胞MCF-7中提取出ALP溶液，在500个微电极阵列中实现数字化分析，如图7(A)。通过MATLAB程序将500个电信号转换成多色球，从而“0”的概率可简单地由暗球数目统计出来。如图7(B-1)和图7(B-2)，对于MCF-7细胞，几乎无亮球，表明ALP分子很少，而Hep G2中检测到较多ALP分子。其原因可能是ALP常作为临床诊断中的标志物，且血清中ALP的升高常与骨头、肝脏等疾病有关。基于方程(3)和(4)，计算得到单个肝癌细胞内ALP含量约为12.1aM，表明该方法可成功用于生物体系中ALP的检测。

钒酸钠(Na₃VO₄)是一种常用的ALP抑制剂。为了考察数字化单分子检测在复杂体系中的选择性和特异性，Hep G2+Na₃VO₄和MCF-7作为对照组。如图7(C)，只有Hep G2细胞中检测到明显的ALP分子，表明该方法具有良好的特异性。

通过以上各项检测，证明本发明可以很好地解决单分子电化学的可靠性问题，推动其在复杂体系中的实际应用，而且该方法简单、灵敏度高、特异性好，无需复杂仪器。本发明还可以推广到其它单个生物分子、单细胞的检测。