一种均相电化学传感器、制备方法及其用途与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种均相电化学传感器、制备方法及其用途。具体基于双链双链DNA为模板制备铜纳米粒子的方均相电化学传感器，可以实现对莱克多巴胺的灵敏检测。

背景技术：

近年来，药物兴奋剂容易过度积累的残留在动物组织中,并可能使人类急性中毒时,产生肌肉震颤的症状,心脏心悸、心动过速、混乱和紧张。其中，莱克多巴胺，一个典型的β-兴奋剂，最初药物用于促进血管舒张，支气管扩张，增加心率，通常用于治疗哮喘和肺病。后来，曾一度被广泛用于喂养家畜高剂量来提高增长率和增加瘦肉的比例。

对于莱克多巴胺的检测，目前有很多方法，大致可以分为两类：一类是最常用的传统方法是色谱法，另一类是电化学传感法；后者又有电化学免疫传感和电化学适配体传感检测。

据不完全统计，从1998年以来，在中国大约已有3000多人由于食用残留莱克多巴胺的猪肉和猪内脏而中毒。为了确保食品安全,莱克多巴胺的使用已被中国,俄罗斯和欧盟禁止在动物饲养中。

因此,有必要提出一个简单的、灵敏的和有选择性的方法常规监测莱克多巴胺的残留。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种均相电化学传感器、制备方法及其用途；本发明提供了基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子来检测莱克多巴胺的新型均相电化学传感器的方法，利用DNA双链为模板，使用抗坏血酸钠柠檬酸钠还原法合成了铜纳米粒子(CuNPs)，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，构建了一个发夹DNA级联放大系统，通过DNA Trigger引发这个放大系统，利用铜纳米粒子作为模拟酶对双氧水产生响应作为信号进行检测。

本发明提供的一种均相电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将2.5OD的DNA Aptamer、DNA Trigger、DNA HP1、DNA HP2序列分别溶解在缓冲溶液中，分别得到DNA Aptamer缓冲溶液、DNA Trigger缓冲溶液、DNA HP1缓冲溶液和DNA HP2缓冲溶液；

(2)、将DNA Aptamer缓冲溶液和DNA Trigger缓冲溶液混合，培养，制备成DNA Aptamer-Trigger溶液；

(3)、将步骤(2)得到的DNA Aptamer-Trigger溶液和莱克多巴胺溶液混合杂交，莱克多巴胺将DNA Aptamer从DNA Aptamer-Trigger上剥夺下来，从而得到DNA Trigger的溶液；

(4)、将步骤(3)得到DNA Trigger的溶液和DNA HP1、DNA HP2缓冲溶液混合，杂交，制备成DNA HP1-HP2溶液；

(5)、室温下在步骤(4)得到DNA HP1-HP2溶液中，加入抗坏血酸钠，然后，加入硫酸铜培养；制得基于双链DNA为模板制备的铜纳米粒子，作为均相电化学传感器。

进一步，步骤(1)具体为，为将购买的分别为2.5OD的DNA Aptamer、DNA Trigger、DNA HP1和DNA HP2序列分别溶解在pH为7.4,浓度为0.01M的MOPS缓冲溶液中；分别得到浓度为100μM的DNA Aptamer缓冲溶液、DNA Trigger缓冲溶液、DNA HP1缓冲溶液和浓度为100μM DNA HP2缓冲溶液，在4℃下保存备用；

其中DNA Aptamer:5’-CGGGCGTGA-3’；

DNA Trigger(含有f和g 2个DNA序列段):5’-TCACGCTA_TATATATATATATATA-3’；

DNA HP1(含有a、b、c、d和e 5个DNA序列段):3’-AGTGCGAT_ATATATATATATATAT_CCATGTGTAGTT_ATATATAT_ATATATA T-5’；

DNA HP2(含有d^*、c^*、b^*和a^*4个DNA序列段):

ATATATAT_AACTACACATGG_ATATATATATATATAT_CCATGTGTAGTT-5’。

以上a、b、c、d、e、d^*、c^*、b^*、a^*、f和g仅仅是为了区别不同DNA序列段的序号，不具有其他任何含义。

进一步，步骤(2)具体为：将步骤(1)制备的DNA Aptamer缓冲溶液、DNA Trigger缓冲溶液稀释至2μM，将20μL 2μM DNA Aptamer缓冲溶液和16μL 2μM DNA Trigger缓冲溶液混合，在25-45℃下培养20min，制备成DNA Aptamer-Trigger溶液；

步骤(3)具体的为：将步骤(2)得到的DNA Aptamer-Trigger溶液和不同浓度的莱克多巴胺溶液混合，在25-45℃下杂交20min得到DNA Trigger的溶液；莱克多巴胺的浓度分别为0,0.001,0.0015,0.003,0.006,0.01,0.03,0.1,1,1.5,5,10,30,60,90,150,300nM。

进一步的，步骤(4)具体为：将步骤(3)得到DNA Trigger的溶液和40μL 4μΜ DNA HP1、40μL 4μΜ DNA HP2缓冲溶液混合，在25-45℃下杂交2h，制备成DNA HP1-HP2溶液；

步骤(3)得到DNA Trigger的溶液和DNA HP1、DNA HP2缓冲溶液混合，杂交，DNA Trigger和DNA HP1形成双链HP1-T，HP1-T有一段裸露的d段可以与HP2上的d^*段杂交，逐渐取代Trigger链，HP2进一步与HP1杂交得到DNA HP1-HP2溶液，剥夺下来的DNA Trigger可参与下一次循环；

进一步的，步骤(5)为：室温下，在步骤(4)得到DNA HP1-HP2溶液中加入抗坏血酸钠，10min后，加入硫酸铜溶液培养5min；得到基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子；铜纳米粒子大小为4-6nm，抗坏血酸钠和硫酸铜的浓度分别为6mM和600μM，体积各8μL；最终溶液体积为200μL，其中铜纳米粒子的制备：利用抗坏血酸钠还原法，先合成出尺寸均匀的CuNPs，此纳米颗粒具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。

本发明提供的一种均相电化学传感器，采用上述方法制备得到。

本发明提供的一种均相电化学传感器的用途，用来检测莱克多巴胺。

具体检测方法为：将基于双链DNA为模板制备的铜纳米粒子加入含有双氧水的MOPS缓冲液中，用裸玻碳电极进行循环伏安法检测；根据不同标准浓度的莱克多巴胺制备的铜纳米粒子对应的信号强度，构建信号强度与莱克多巴胺浓度的线性关系，实现对莱克多巴胺检测。

具体为：裸玻碳电极浸入到3mL含有200μL上述制备铜纳米粒子溶液和终浓度100mM双氧水的MOPS缓冲溶液中，在室温下，进行循环伏安法检测。

进一步的，所述裸玻碳电极经过抛光处理，具体处理为：玻碳电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO₃:H₂O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

以上所用MOPS缓冲液的pH为4.1-10，最优的pH为7.4。

由于双氧水可以被以双链DNA为模板的制备出的铜纳米粒子催化氧化，所以在裸玻碳电极浸入含有双氧水的MOPS缓冲溶液中，双氧水作为信号分子，用循环伏安法进行检测。双氧水氧化的信号强度与双链DNA铜纳米的量相关，也就与DNA Trigger浓度有关，也就间接与莱克多巴胺的浓度有关。随着莱克多巴胺浓度的增加，循环伏安法的峰强度即双氧水氧化的信号强度会随之增加，构建信号强度与莱克多巴胺浓度的线性关系，实现对莱克多巴胺的检测。因此，此均相溶液可对不同浓度莱克多巴胺进行定量检测。

本生物传感器的制备方法，使用铜纳米粒子合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，将DNA，铜纳米粒子进行关联，进而利用DNA碱基互补配对原则构建成一个发夹DNA级联放大系统，因此制备更多的具有电化学活性的铜纳米粒子，从而使得电化学检测信号得到放大。利用双氧水氧化产生的循环伏安法强度信号，构建与莱克多巴胺浓度的线性关系，实现对莱克多巴胺的检测。因此对莱克多巴胺的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性好的特点。

附图说明

图1为基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子来检测莱克多巴胺的新型均相电化学传感器示意图；

图2A为DNA-铜纳米粒子的透射电子显微镜表征图；

图2B为3mL pH 7.4MOPS缓冲溶液含有不同物质的循环伏安图；

a为没有DNA-铜纳米粒子没有双氧水存在下的循环伏安图；

b为有DNA-铜纳米粒子没有双氧水存在下的循环伏安图；

c为没有DNA-铜纳米粒子有100mM双氧水存在下的循环伏安图；

d为有DNA-铜纳米粒子有100mM双氧水存在下的循环伏安图；

图2C为DNA-铜纳米粒子在不同浓度双氧水均相溶液中的循环伏安图；

a为0μM双氧水，b为10μM双氧水，c为20μM双氧水，d为50μM双氧水，e为100μM双氧水，f为200μM双氧水，g为500μM双氧水，h为1000μM双氧水，i为5000μM双氧水，j为10000μM双氧水，k为25000μM双氧水，l为50000μM双氧水，m为75000μM双氧水，n为100000μM双氧水。

图2D为DNA-铜纳米粒子在不同浓度双氧水均相溶液中的线形图；

图2E为有良好线性的指数图；

图2F为紫外可见吸收光谱图，插入图为可见的TMB显示对比；

a为TMB双氧水溶液的紫外可见吸收光谱图；

b为DNA-铜纳米粒子在TMB双氧水溶液中的紫外可见吸收光谱图；

图3A为3mL pH 7.4MOPS缓冲溶液含有不同物质的循环伏安图；

a为只有10mM抗坏血酸钠存在无其他物质存在时的循环伏安图；

b为只有100mM双氧水存在无其他物质存在时的循环伏安图；

c为10mM抗坏血酸钠和100mM双氧水存在时的循环伏安图；

d为800μM铜离子和100mM双氧水存在时的循环伏安图；

e为10mM抗坏血酸钠和800μM铜离子和100mM双氧水存在时的循环伏安图；

f为6mM抗坏血酸钠,600μM铜离子和DNA(200nM Aptamer,160nM Trigger,800nM HP1,800nM HP2)和100mM双氧水存在时的循环伏安图；

g为6mM抗坏血酸钠,600μM铜离子和1nM莱克多巴胺and DNA(200nM Aptamer,160nM Trigger,800nM HP1,800nM HP2)和100mM双氧水存在时的循环伏安图；

图3B为加入不同浓度Trigger后的循环伏安图；

a为0nM Trigger，b为10nM Trigger，c为20nM Trigger，d为40nM Trigger，e为60nM Trigger，f为80nM Trigger，g为100nM Trigger，h为120nM Trigger，i为140nM Trigger，j为160nM Trigger，k为180nM Trigger，l为200nM Trigger。

图3C为DNA-铜纳米粒子制备时加入不同浓度DNA Trigger与电流的线性图；

图3D表明Trigger浓度在0-160nM呈现良好线性；

图4A为铜离子浓度值对本实验的影响图；

图4B为抗坏血酸钠浓度值对本实验的影响图；

图4C DNA HP1和DNA HP2浓度值对本实验的影响图；

图4D DNA HP2浓度值对本实验的影响图；

图4E为pH值对本实验的影响图；

图4F为实验温度的优化图；

图4G为发夹DNA级联放大体系时间的优化图；

图4H为DNA Aptamer和DNA Trigger杂化时间的优化图；

图5A基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子均相电化学传感器对不同浓度莱克多巴胺的循环伏安图；

a为0nM的莱克多巴胺，b为0.001nM的莱克多巴胺，c为0.0015nM的莱克多巴胺，d为0.003nM的莱克多巴胺，e为0.006nM的莱克多巴胺，f为0.01nM的莱克多巴胺，g为0.03nM的莱克多巴胺，h为0.1nM的莱克多巴胺，i为1nM的莱克多巴胺，g为1.5nM的莱克多巴胺，k为5nM的莱克多巴胺，l为10nM的莱克多巴胺，m为30nM的莱克多巴胺，n为60nM的莱克多巴胺，o为90nM的莱克多巴胺，p为150nM的莱克多巴胺，q为300nM的莱克多巴胺；

图5B为此传感器对不同浓度莱克多巴胺的曲线；

图5C为此传感器对不同浓度莱克多巴胺的指数标准曲线。

具体实施方式

实施例1

一种均相电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)、为将购买的分别为2.5OD的DNA Aptamer、DNA Trigger、DNA HP1、DNA HP2序列分别溶解在pH为8,浓度为0.01M的MOPS缓冲溶液中分别得到浓度为100μM的DNA Aptamer缓冲溶液、DNA Trigger缓冲溶液、DNA HP1缓冲溶液和浓度为100μM DNA HP2缓冲溶液，在4℃下保存备用；其中DNA Aptamer:5’-CGGGCGTGA-3’，DNA Trigger(f g):5’-TCACGCTA_TATATATATATATATA-3’，DNA HP1(a b c d e):

3’-AGTGCGAT_ATATATATATATATAT_CCATGTGTAGTT_ATATATAT_ATATATA T-5’，HP2(d^*c^*b^*a^*):3’-ATATATAT_AACTACACATGG_ATATATATATATATAT_CCAT GTGTAGTT-5’；

(2)、将DNA Aptamer缓冲溶液、DNA Trigger缓冲溶液稀释，然后，将20μL 2μM DNA Aptamer缓冲溶液和16μL 2μM DNA Trigger缓冲溶液混合，在37℃下培养20min，制备成DNA Aptamer-Trigger溶液；

(3)、将步骤(2)得到的DNA Aptamer-Trigger溶液和7μL莱克多巴胺溶液混合，在37℃下杂交20min得到DNA Trigger的溶液；莱克多巴胺的浓度分别为0,0.001,0.0015,0.003,0.006,0.01,0.03,0.1,1,1.5,5,10,30,60,90,150,300nM。莱克多巴胺将DNA Aptamer从DNA Aptamer-Trigger上剥夺下来，从而得到DNA Trigger的溶液。

(4)、将步骤(3)得到DNA Trigger的溶液和40μL 4μΜ DNA HP1缓冲溶液、40μL 4μΜ DNA HP2缓冲溶液混合，在37℃下杂交2h，制备成DNA HP1-HP2溶液；DNA Trigger和DNA HP1形成双链HP1-T，HP1-T有一段裸露的d段可以与HP2上的d^*段杂交，逐渐取代Trigger链，HP2进一步与HP1杂交得到DNA HP1-HP2溶液，剥夺下来的DNA Trigger可参与下一次循环；

(5)、室温下，在步骤(4)得到DNA HP1-HP2溶液中加入抗坏血酸钠培养，10min后加入硫酸铜，培养5min；得到基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子。加入的抗坏血酸钠和硫酸铜的浓度分别为6mM和600μM，体积分别为8μL；最终溶液体积为200μL，就制得了大小5nm左右的铜纳米粒子。其中铜纳米粒子的制备：利用抗坏血酸钠还原法，先合成出尺寸均匀的CuNPs，此纳米颗粒具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。

(6)、将抛光处理后的裸玻碳电极浸入到3mL含有上述制备的200μL含有铜纳米粒子的溶液和终浓度100mM双氧水的MOPS缓冲溶液中，在室温下，进行循环伏安法检测；得到不同浓度的莱克多巴胺浓度对应的信号强度，如图5B；构建信号强度与莱克多巴胺浓度的线性关系，如图5C，利用此线性关系实现对莱克多巴胺的检测。

所述抛光处理后的玻碳电极是指：玻碳极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO₃:H₂O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。

本发明提供的一种均相电化学传感器对莱克多巴胺的检测的应用。

具体应用方法为：

以上使用的缓冲溶液的pH为7.4。

其他条件不变，实验在缓冲溶液的pH为4.1,4.5,5,5.5,6,6.5，7，7.4,7.6，7.8,8,8.5,9,10时都可以进行，但是在7.4时信号增加缓慢，如图4E，选择pH 7.4作为实验优化条件。

实施例2

选择pH 7.4的缓冲溶液，仅仅改变所有培养温度，其他操作同实施例1；结果如图4F，20～45℃均可以实现本发明，但是实验的培养温度为37℃时，实验的效果最好。

实施例3

选择pH 7.4的缓冲溶液，培养温度为37℃时，仅仅改变DNA级联放大实验培养时间，结果如图4H，表明DNA级联放大实验培养时间应为2h为最佳时间。

利用本发明制备的传感器的检测结果与现有技术相比，检测范围、检测限对比：结果如下表1：

表1：

本申请检测范围广，0.001-300nM，检测限为0.3pM，而且，检测方法简单，灵敏度高，稳定性好。

实施例4

一种均相电化学传感器检测莱克多巴胺的应用，包括以下步骤：

(1)、将购买的分别为2.5OD的DNA Aptamer、DNA Trigger、DNA HP1、DNA HP2序列分别溶解在pH为7.4，浓度为0.01M的MOPS缓冲溶液中分别得到浓度为100μM的DNA Aptamer、DNA Trigger、DNA HP1缓冲溶液和浓度为100μM DNA HP2缓冲溶液，在4℃下保存备用；其中DNA Aptamer:5’-CGGGCGTGA-3’，DNA Trigger(f g):5’-TCACGCTA_TATATATATATATATA-3’，DNA HP1(a b c d e):

3’-AGTGCGAT_ATATATATATATATAT_CCATGTGTAGTT_ATATATAT_ATATATA T-5’，HP2(d^*c^*b^*a^*):3’-ATATATAT_AACTACACATGG_ATATATATATATATAT_CCATGTGTAGTT-5’；

(2)、将20μL 2μM DNA Aptamer缓冲溶液和16μL 2μM DNA Trigger缓冲溶液混合，在37℃下培养20min，制备成DNA Aptamer-Trigger溶液；

(3)、将步骤(2)得到的DNA Aptamer-Trigger溶液和莱克多巴胺溶液混合，在37℃下杂交20min得到DNA Trigger的溶液；此处的莱克多巴胺通过以下方法获得：5个空白猪尿液各4克，加入100毫升聚丙烯离心管中同时加入适量莱克多巴胺试剂。然后将20毫升乙醇/水＝9/1(体积比)混合液加入离心管中。剧烈摇晃10分钟后，混合液在3000转下离心20分钟。重复提取上清液两次。获得的上清液在旋转蒸发仪中60摄氏度减压蒸干。获得的干的提取物再次溶解于4毫升甲醇中，然后通过0.22微米尼龙过滤器过滤，用20毫升甲醇。最终这些获得的稀释的莱克多巴胺样品分别加入Aptamer-Trigger混合液中培养20分钟。莱克多巴胺的浓度分别为10,50,100,500,1000pM。

(4)、将步骤(3)得到DNA Trigger的溶液和40μL 4μΜ DNA HP1、40μL 4μΜ DNA HP2缓冲溶液混合，在37℃下杂交2h，制备成DNA HP1-HP2溶液；

(5)、室温下将步骤(4)得到DNA HP1-HP2溶液，加入抗坏血酸钠培养10min，然后加入硫酸铜培养5min，得到基于双链DNA为模板制备铜纳米粒子，铜纳米粒子大小5nm；抗坏血酸钠和硫酸铜的浓度分别为6mM和600μM，体积各为8μL，最终溶液体积为200μL，其中铜纳米粒子的制备：利用抗坏血酸钠还原法，先合成出尺寸均匀的CuNPs，此纳米颗粒具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。

(6)、抛光处理后的玻碳电极浸入到3mL含有上述制备的200μL铜纳米粒子溶液和终浓度100mM双氧水的MOPS缓冲溶液中，在室温下，进行循环伏安法检测，利用实施例1制备得到的莱克多巴胺浓度与电信号的线性关系，得到样品莱克多巴胺的浓度，结果如下表2：

表2：猪空白尿液中进行莱克多巴胺实样检测。

如表2所示，加入的样品莱克多巴胺有良好的回收率，87.4到107.0％，相对标准偏差为5.8到9.4％，证明了我们的方法对于实样检测是可靠并且灵敏的。