透明质酸(HA)测试试剂盒及其制备方法与流程

文档序号:12119373阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种透明质酸测试试剂盒,其特征在于,包括:

磁分离试剂,标记HABP蛋白的纳米磁性微球,浓度为167μg/ml;

试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白,所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml;

试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;

含有HA抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品;

清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;

稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;

发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。

2.根据权利要求1所述的透明质酸测试试剂盒,其特征在于,各试剂体积比为:磁分离试剂4-6,试剂R1 4-6,试剂R2 4-6,标准品4-6,质控品1-3,校准品1-3,清洗浓缩液20-30,稀释液10-20,发光底物25-40。

3.如权利要求1或2所述的透明质酸测试试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)磁分离试剂的制备

配制磁珠缓冲液:分别称取Tris、NaCl于容器中,配制Tween-20溶液,倒入所述容器中;量取Proclin-300,溶解于水中后倒入所述容器中,在所述容器中加入水,并充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH值在7.95~8.05范围内;称取BSA V(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中;定容,配制溶液中Tris浓度为4.58g/L,NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L,浓度0.02%的Proclin-300,BSA V浓度为3g/L,PH值在7.95~8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2~8℃下保存;

配制磁分离试剂:将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中,配制成浓度为20mg/mL的溶液;取HABP蛋白溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中,浓度为2mg/mL;将DSS溶液加入到HABP蛋白溶液中,室温放置90分钟;离心处理;另取浓度为100mg/ml的磁珠,按与HABP蛋白溶液的体积比为1:2量取,加入反应杯中,经磁铁吸附2分钟后吸取上清液;用PH 9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠;将离心处理后的浓缩HABP蛋白溶液加入到清洗后的磁珠中混匀,室温放置4小时,保持混匀状态;磁珠-HABP蛋白混合液中加入1mol/L的Tris溶液,37℃下放置15分钟,所述Tris的加样量为1mgHABP蛋白加0.15mlTris;用PH 7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好HABP蛋白的磁珠;用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05%的HA磁分离试剂;再将制得的HA磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀得磁分离试剂;

(2)试剂R1的制备

试剂R1稀释液的配制:量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35~7.45范围内;加入BSA V;定容,配制溶液中Tris浓度为6.06g/L,NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L,Proclin-300的浓度0.02%,MgCl2的浓度为0.05g/L,BSA V浓度为3g/L,PH在7.35~7.45范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2~8℃下保存;

配制试剂R1,称取1mg碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中,离心浓缩处理;与离心浓缩后的ALP浓缩液按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;将搅拌后ALP溶液透析处理;透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液,使醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,立即加入aggrecan蛋白,加入aggrecan蛋白的量按与ALP的重量比为1:10加入,在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀,置于4℃下2小时;透析处理;之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵,置于4℃下1小时;离心处理弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵清洗,将沉淀物溶于浓度为0.15M、PH7.4的PBS溶液中;透析处理,去除铵离子;离心处理去除沉淀,上清液为酶结合物,按与1M Mgcl2溶液100:1的体积比加入1M Mgcl2溶液,与制得的酶反应物稀释液以1:100的体积比混合均匀,即的试剂R1

(3)试剂R2的制备

称取Tris、NaCl于容器中,量取Proclin-300,用水溶解后加入到所述容器中;在所述容器中加水,搅拌,使得加入到所述容器中的试剂完全溶解,调节PH在7.35~7.45的范围内;称取牛γ球蛋白(IgG),加入到所述容器中;定容,配制溶液中,Tris浓度为1.56g/L,NaCl浓度为4.23g/L,Proclin-300的浓度0.02%,牛γ球蛋白(IgG)的浓度为0.9g/L,PH在7.35~7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2~8℃下保存;

(4)标准品、质控品及校准品的配制

HA标准品配制浓度为0,25,180,200,600,1500ng/ml;质控品配制浓度点为47.5,600ng/ml;校准品配制浓度为70,600ng/ml;充分混匀后,2-8℃下保存;

(5)清洗浓缩液的配制

称取Tris和NaCl于容器中,称取Tween-20于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;向所述容器中加入水,充分搅拌,使所加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35~7.45范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为12.54g/L,NaCl浓度为325.6g/L,Tween-20浓度为5g/L,Proclin-300的浓度0.02%,PH在7.35~7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2~8℃下保存;

(6)稀释液的配制

称取NaCl和BSA V于容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;定容,配制溶液中NaCl浓度为9g/L和BSA V浓度为60g/L,Proclin-300的浓度0.05%,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2~8℃下保存;

(7)发光底物的配制

称取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.95~8.05的范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为2.35g/L,NaCl浓度为6.41g/L,Na2SO3浓度为0.002g/L,Proclin-300的浓度为0.02%,PH在7.95~8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后,配制溶液与IUMIPHOS530按4:1的体积比加入IUMIPHOS530,混匀后于2~8℃下保存。

4.根据权利要求3所述的透明质酸测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,DSS的投入量计算公式为:投入量=HABP蛋白质量/16000×10×368/CDSS

5.根据权利要求3所述的透明质酸测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述离心处理为将加入DSS的HABP蛋白溶液于高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩30分钟,至浓缩体积为小于0.5ml。

6.根据权利要求3所述的透明质酸测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述磁珠直径为0.9~1.5μm,加入浓度为100mg/ml的磁珠。

7.如权利要求1或2所述的透明质酸测试试剂盒的测试方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)加HA标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;

(2)加试剂R1至每一试管中;

(3)加试剂R2至每一试管中;

(4)加磁分离试剂至每一试管中;

(5)各试管内试剂混匀后,置37℃水浴30分钟;

(6)将各试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟;缓慢倒出上清液,除去各试管内的液滴;

(7)清洗浓缩液用水稀释7倍后,加稀释后的清洗液至每一试管中,混匀;

(8)重复操作步骤(5)、(6)、(5)一遍;

(9)加底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。

8.根据权利要求7所述的透明质酸测试试剂盒的测试方法,其特征在于,所述步骤(1)之前使用校准品进行曲线校正,并用质控品进行质量控制。

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