一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法与流程

文档序号:12155969阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,步骤包括:将待测样品溶液加入到氨基酸分析仪中,用缓冲液B1~B5进行梯度洗脱,洗脱程序包括:

第一阶段:用缓冲液B1洗脱,持续时间20~21min;初始柱温37.5~39℃,第2.0~2.1min时降至34.5~35.5℃,第一阶段结束时将柱温升至55.5~56.5℃;

第二阶段:用缓冲液B1和B2洗脱,持续时间11.5~12.5min;先将柱温升至57.5~58.5℃,瞬时调整为B1 78%~82%、B2 18%~22%;再匀速变化为B1 68%~72%、B2 28%~32%,第二阶段结束时柱温降至55.5~56.5℃;

第三阶段:瞬时调整为缓冲液B1 8%~12%、缓冲液B2 88%~92%,按这一比例洗脱9~10min,并在第2.8~3.1min时柱温降至41.5~42.5℃;

第四阶段:用缓冲液B2洗脱5~6min,并在第四阶段结束时将柱温升至71.5~72.5℃;

第五阶段:用缓冲液B3和B4洗脱,16.5~17.5min内从缓冲液B3 68%~72%、缓冲液B4 28%~32%匀速调整为缓冲液B3 58%~62%、缓冲液B438%~42%;

第六阶段:用缓冲液B3和B4洗脱,2~3min内匀速调整为B3 54%~56%、B4 44%~46%;

第七阶段:用缓冲液B4洗脱17~18min;

第八阶段:用缓冲液B5洗脱4~8min;

上述比例均为体积比;

所述的缓冲液B1为pH=2.75~2.85的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系;

所述的缓冲液B2为pH=3.65~3.75的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系;

所述的缓冲液B3为pH=3.55~3.65的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系;

所述的缓冲液B4为pH=4.05~4.15的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系;

所述的缓冲液B5为氢氧化锂水溶液。

2.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述洗脱程序包括:

第一阶段为第0~20.8min,用缓冲液B1洗脱,初始柱温37.5~39℃,第2.1min时调整为34.5~35.5℃,第一阶段结束时将柱温升至55.5~56.5℃;

第二阶段为第20.8~32.8min,用缓冲液B1和B2洗脱,将柱温升至57.5~58.5℃,从B1 78%~82%、B2、18%~22%,匀速调整为B1 68%~72%、B2 28%~32%;第二阶段结束时柱温调整为55.5~56.5℃;

第三阶段为第32.8~42.5min,瞬时调整为缓冲液B1 8%~12%,缓冲液B2 78%~82%,并按这一比例洗脱;第35.8min时柱温降至41.5~42.5℃;

第四阶段为第42.5~48.0min,用缓冲液B2洗脱,第四阶段结束时柱温升至71.5~72.5℃;

第五阶段为第48.0~65.0min,从缓冲液B3 68%~72%、缓冲液B4 28%~32%,匀速调整为缓冲液B3 54%~56%、缓冲液B4 44%~46%;

第六阶段为第65.0~67.5min,匀速变化为缓冲液B3 54%~56%,缓冲液B4 44%~46%;

第七阶段为第67.5~84.5min,用缓冲液B4进行洗脱;

第八阶段为第84.5~89.0min,用缓冲液B5进行洗脱。

3.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述洗脱程序包括:

第一阶段为第0~20.8min,用缓冲液B1洗脱,初始柱温38℃,第2.1min时调整为35℃,第一阶段结束时将柱温升至56℃;

第二阶段为第20.8~32.8min,用缓冲液B1和B2洗脱,将柱温升至58℃,从缓冲液B1 80%、B2 20%匀速调整为B1 70%、B2 30%,第二阶段结束时柱温调整为56℃;

第三阶段为第32.8~42.5min,调整为缓冲液B1为10%,缓冲液B2为90%,并按这一比例洗脱;第35.8min时柱温调整为42℃;

第四阶段为第42.5~48.0min,用缓冲液B2洗脱,第42.0min时柱温调整为72℃;

第五阶段为第48.0~65.0min,瞬时调整为缓冲液B3 70%,缓冲液B430%,并匀速调整为B3为60%、B4为40%;

第六阶段为第65.0~67.5min,匀速调整为缓冲液B3为55%,缓冲液B4为45%;

第七阶段为第67.5~84.5min用缓冲液B4洗脱;

第八阶段为第84.5~89min,用缓冲液B5洗脱。

4.根据权利要求1~3任一项所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于:

所述的缓冲液B1含有5.5~6g/L柠檬酸三锂、1~1.5g/L氯化锂、19~21g/L柠檬酸、体积含量2.5%~3.5%的乙醇和体积含量0.005%~0.015%的辛酸;

缓冲液B2含有9.5~11g/L柠檬酸三锂、6~7.5g/L氯化锂、11.5~13g/L柠檬酸、体积含量2.5%~4%乙醇和体积含量0.005%~0.015%辛酸;

缓冲液B3含有8.5~9.6g/L柠檬酸三锂、25~28g/L氯化锂、11~12g/L柠檬酸、体积含量8%~12%乙醇、体积含量3.5%~5%的苯乙醇和体积含量0.005%~0.0.15%的辛酸;

缓冲液B4含有9.5~11g/L柠檬酸三锂、37.5~40g/L氯化锂、3~4g/L柠檬酸和体积含量0.005%~0.015%辛酸;

缓冲液B5含有8~10g/L氢氧化锂、体积含量2.5%~4%乙醇和体积含量0.005%~0.015%辛酸。

5.根据权利要求4所述的同时测定活性肽及游离氨基酸含量的方法,其特征在于,

所述的缓冲液B1的pH=2.8,含有5.73g/L柠檬酸三锂、1.24g/L氯化锂、19.9g/L柠檬酸、体积含量3.0%乙醇和体积含量0.01%辛酸;

缓冲液B2的pH=3.7,含有9.8g/L柠檬酸三锂、6.36g/L氯化锂、12.0g/L柠檬酸、体积含量3%乙醇和体积含量0.01%辛酸;

缓冲液B3的pH=3.6,含有8.79g/L柠檬酸三锂、26.62g/L氯化锂、11.27g/L柠檬酸、体积含量10%的乙醇、体积含量0.4%的苯乙醇和体积含量0.01%的辛酸;

缓冲液B4的pH=4.1,含有9.8g/L柠檬酸三锂、38.15g/L氯化锂、3.3g/L柠檬酸和体积含量0.01%辛酸;

缓冲液B5含有8.4g/L氢氧化锂、体积含量3%乙醇和体积含量0.01%辛酸。

6.如权利要求1~3任一项所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,采用茚三酮衍生试剂显色;显色波长分别为440nm和570nm。

7.如权利要求6所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述茚三酮衍生试剂包括茚三酮反应液、反应缓冲液和洗涤液;

茚三酮反应液为茚三酮和硼氢化钠的溶液,溶剂选自乙二醇单甲基醚或丙二醇单甲基醚,茚三酮浓度为38~40g/L,硼氢化钠浓度为80~82mg/L;

反应缓冲液为乙酸钠、冰醋酸、水与有机溶剂的混合溶液;所述有机溶剂选自乙二醇单甲基醚或丙二醇单甲基醚;所述有机溶剂与冰醋酸、水的体积比为1:0.25~0.35:0.8~0.85;所述乙酸钠与超纯水的质量比为1:1.6~1.7;

洗涤液为乙醇水溶液;所述乙醇与水的体积比为1:18.5~19.5。

8.根据权利要求1~3任一项所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述活性肽包括谷胱甘肽和肌肽中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述待测液的制备方法包括以下步骤:

a.样品与盐酸溶液、抗氧化剂混合,均质后超声处理,固液分离;抗氧化剂与待测水产品样品的质量比为1:50~500;所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、连二亚硫酸钠或维生素C,

b.步骤a的固体再次用盐酸溶液提取1~5次;

c.合并步骤a、b的上清液后用盐酸溶液定容,然后加入磺基水杨酸,离心、过滤,取滤液;

上述各步骤所用盐酸溶液浓度为0.005~0.1mol/L。

10.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法,其特征在于,所述待测液的制备方法包括以下步骤:

a.将待测样品与盐酸混合,加入二硫苏糖醇,均质后超声处理3~20min,0~20℃离心,取上清液;二硫苏糖醇与待测水产品样品的质量比为1:100~400;待测样品与盐酸的用量比为1g:5~10mL;

b.取步骤a离心得到的固体,与盐酸混合后搅拌、离心取上清液,重复1~5次;待测样品与盐酸的用量比为1g:3~8mL;

c.合并步骤a和步骤b的上清液,用盐酸溶液定容并加入磺基水杨酸,使磺基水杨酸的含量为2wt%~3wt%;离心后用0.2~0.5μm滤膜过滤取滤液得到待测液;

上述各步骤所用盐酸溶液浓度为0.01~0.05mol/L。

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