用于评估肝纤维化进展的非侵入方法与流程
本申请是申请号为201080021790.1、申请日为2010年3月18日、发明名称为“用于评估肝纤维化进展的非侵入方法”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及肝脏病学的领域，并且特别地涉及尤其在酒精性或病毒性或代谢性慢性肝病中用于评估肝纤维化进展的非侵入方法。
背景技术：
肝纤维化指的是纤维性瘢痕组织在肝中的积累。为了诊断肝纤维化，可以使用各种技术。这些技术中的一种是肝针吸活检(lnb)，基于肝中(特别是肝叶中)的病变的观察生成分类。实际上，最常用的分类之一是metavir分类，其将肝纤维化分类为从f0至f4的五个阶段。根据metavir分类，f≥2阶段表示纤维化在临床上是显著的，而f4阶段对应于最后阶段，即硬化。
也可以单独地或与lnb或metavir分类组合使用其他技术，以便更精确地确定个体中的肝纤维化的程度，所述其他技术例如通过纤维化评分(例如fibrometertm)、纤维化面积(aof)评分以及定量图像分析来衡量个体中的纤维化的存在或严重性。
然而，如果检测肝纤维化的存在或严重性具有高度的重要性，则观察到纤维化的进展速度在个体之间是不同的。因此，肝纤维化进展的评估由于诊断和治疗原因在临床实践中是很重要和有用的工具。
首先，考虑到肝纤维化进展取决于各种遗传和宿主因素，它可能的确有用于提前确定预期在患者的寿命期间肝纤维化将朝着硬化进展是否合理，并且如果这样的话则该进展将以什么样的速度发生。
其次，评估肝纤维化的进展速度也可以有用于帮助医生决定是否治疗患者或帮助他们监测已经在进行着治疗方案的患者。迄今为止，医生主要依赖于纤维化分段(加重metavir阶段≥f2)以便证明对慢性病毒性肝炎的抗病毒治疗是正当的。然而，它将很有用于例如但不限于表现出f0或f1的患者提早知道他的肝纤维化是否将快速演变成临床上显著的纤维化或硬化，以便医生预期治疗。
若干文献公开了为了评估肝纤维化进展而开发的技术。wo03/064687公开了一种用于评估患者的肝硬化的形成和进展风险的方法，所述方法包括确定患者的凝血因子的基因型或表现型的步骤。wo2006/003654公开了用于确定受慢性丙型肝炎感染的个体体质发展成快速进展速度的肝纤维化的方法和套件。该方法基本上在于确定在个体的cyp2d6基因座中是否存在至少一个快速进展肝纤维化相关的基因型。ep1887362a1公开了一种肝病评价方法，所述方法包括从氨基酸浓度数据计算指示肝纤维化程度的指数的步骤。尽管前述方法可以评估肝纤维化进展，但是它们需要在临床实践中不容易获得的复杂的生物分析。
因此，仍然需要一种可以评价纤维化的进展的低成本且容易获得的方法，所述方法非侵入、无损伤、精确且可靠，并且使用简单。
技术实现要素：
为了本发明的目的，
“评分”是旨在预测临床事件或病变(例如纤维化程度)的指标(或变量)的组合。通常，并且尤其当使用二元逻辑回归时，评分范围从0(0％风险)至1(100％风险)，即诊断目标的概率。当评分依赖于多线性回归时，评分产生以与诊断目标相同的单位计的结果。在本发明中，主评分从多线性回归导出并且衡量纤维化的进展速度，即表达为每时间单位的纤维化单位。
“进展”表示纤维化水平随着时间的演变。
“定期”表示以规则的时间间隔，例如每10天、每月或每年等。
“样本”表示个体的生物流体，例如个体的血液、血清、血浆、尿或唾液。
“非侵入”表示不从个体的身体取走组织(血液不被视为组织)。
“个体”表示女人、男人或动物，年青的或年老的，健康的或易患或已患肝病(例如病毒性、酒精性肝纤维化、慢性肝脂肪变性)或任何其他疾病。
“诱因”表示诱发病变和随之而来的疾病的风险因素。
“诱因持续时间”是诱因开始时的年龄(“开始年龄”)和包含测量纤维化水平时的年龄(“包含年龄”)之间的时间。
“纤维化水平”由纤维化评分、aof或分形维数反映，优选地纤维化水平是纤维化评分、aof评分或分形维数评分。
“纤维测定器(fibrometer)”可以表示纤维化评分或aof评分。
本发明提出了在涉及纤维化的所有和任何状况或疾病中评估纤维化的进展速度的技术问题的解决方案。本发明导致纤维化进展的很精确诊断并且能够区分慢、中和快纤维化者(fibroser)。
在优选实施例中，状况或疾病是酒精性或病毒性慢性肝病(cld)。根据另一个实施例，为了评估纤维化的进展速度，评估纤维化面积(aof)的进展速度。
根据本发明的第一实施例，通过计算纤维化水平/诱因持续时间的比率来评估肝纤维化进展。根据优选实施例，由非侵入方法测量纤维化水平。有利地，纤维化水平是纤维化评分，优选fibrometertm、aof评分或分形维数评分。
根据本发明的第二实施例，通过在两个不同的时间间隔t1和t2测量纤维化水平fl(t1)和fl(t2)并且计算fl(t2)-fl(t1)与(t2-t1)的比率来评估肝纤维化进展。
根据本发明，“t1”：是在个体中执行第一测量并且确定第一纤维化水平fl(t1)的时间；
“t2”：是在相同个体中执行第二测量并且确定第二纤维化水平fl(t2)的时间；
“t2-t1”：是至少10天的时间周期；在实施例中，t2-t1是1至6个月的周期；在另一个实施例中，t2-t1是1年的周期。
有利地，纤维化水平是纤维化评分、aof评分或分形维数评分。
根据本发明，“纤维化评分”是通过在个体的样本中测量并且在逻辑或线性回归函数中组合至少3个，优选6至8个指标而获得的评分，所述指标选自由下列构成的组：α-2巨球蛋白(a2m)、透明质酸(ha或玻尿酸)、载脂蛋白a1(apoa1)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、胆红素、γ-球蛋白(glb)、血小板计数(plt)、凝血酶原指数(pi)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、尿素、钠(na)、糖血(gly)、甘油三酯(tg)、白蛋白(alb)、碱性磷酸酶(alp)、人软骨糖蛋白39(ykl-40)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(timp-1)、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、铁蛋白、体重、年龄和性别。
优选地，通过组合至少三个指标的水平来测量纤维化评分，所述指标选自由下列构成的组：糖血(gly)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、铁蛋白、透明质酸(ha)、甘油三酯(tg)、凝血酶原指数(pi)、γ-球蛋白(glb)、血小板计数(plt)、体重、年龄和性别。
更优选地，通过在二元线性回归函数中组合四至八个指标来确定纤维化评分，所述指标优选地选自由下列构成的组：α2巨球蛋白(a2m)、透明质酸或玻尿酸(ah)、凝血酶原指数(pi)、血小板(plq)、asat、尿素、ggt、年龄和性别。根据优选实施例，纤维化评分是fibrometertm或fibrotesttm或fibrospecttm或肝硬化评分(hepascore)。
根据特定实施例，可以根据肝状况是病毒性的还是酒精性的来选择评分的指标。
“纤维化面积”可以由图像分析或由非侵入方法确定，其中通过在所述患者的样本中测量并且然后在逻辑或线性回归函数中，优选在多线性回归函数中组合至少2个，优选3个，更优选6至8个变量而获得评分，所述变量选自由下列构成的组：α-2巨球蛋白(a2m)、透明质酸(ha或玻尿酸)、载脂蛋白a1(apoa1)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、胆红素、γ-球蛋白(glb)、血小板计数(plt)、凝血酶原指数(pi)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、尿素、钠(na)、糖血、甘油三酯、白蛋白(alb)、碱性磷酸酶(alp)、人软骨糖蛋白39(ykl-40)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(timp-1)、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、铁蛋白、年龄、体重、体重指数。
“分形维数”反映肝结构并且可以由图像分析或由非侵入方法获得，其中通过在个体的样本中测量并且然后在逻辑或线性回归函数中(优选在多线性回归函数中)组合至少3个，优选4个指标而获得评分，所述指标选自包括下列或者由下列构成的组：α-2巨球蛋白(a2m)、白蛋白(alb)、凝血酶原指数(pi)、透明质酸(ha或玻尿酸)、丙氨酸转氨酶(alat)、天冬氨酸转氨酶(asat)和年龄。
根据本发明的优选实施例，纤维化水平选自在下表中陈述的评分：
本发明也涉及一种用于评估个体是否是快纤维化者的非侵入方法，包括通过使用上文所述的非侵入方法，优选地通过计算fl/诱因持续时间和/或fl(t2)-fl(t1)/t2-t1来测量所述个体的肝进展，其中fl优选地是纤维化评分、aof评分或分形维数评分。根据本发明，快纤维化者参考统计数据通过逐步二元逻辑回归被识别为具有增加的aof、更年轻的包含年龄和更年老的开始年龄(或代替前两个变量的诱因持续时间)。根据申请人的实验，通过逐步二元逻辑回归诊断精度似乎为100.0％。
本发明也涉及一种参考纤维化者的群体使用判别分析来评估个体是慢、中还是快纤维化者的非侵入方法，所述纤维化者根据他们的纤维化进展速度被分级为三个类别，即慢、中和快纤维化者：首先，如上所述优选地通过aof进展执行评估纤维化进展的方法，并且在由统计分析确定的慢、中、快纤维化者类别中分级个体。在以下的例子2中，截止点为0.58和1.36％/yr，区分慢(52.5％)、中(34.5％)和快(12.9％)纤维化者，其中aof进展分别为：0.42±0.10，0.81±0.21和2.43±0.81％/yr(p<10-3)。优选地由aof进展限定的纤维化者符合纤维化进展：0.09±0.06，0.15±0.06和0.43±0.18mu/yr(p<10-3)，分别对应慢、中和快纤维化者。根据优选实施例，上文所述的非侵入方法优选地是fl/诱因持续时间或fl(t2)-fl(t1)/t2-t1，其中fl优选地是aof评分。
根据本发明的第四实施例，肝纤维化进展由评分评估。
根据第一目的，本发明涉及一种用于评估个体中的肝纤维化进展的非侵入方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述个体的样本中测量至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，更加优选六至八个变量，所述变量选自由下列构成的组：
-生物变量，其选自α-2巨球蛋白(α2m)、透明质酸(ha)、载脂蛋白a1(apoa1)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、胆红素、β-球蛋白、γ-球蛋白(glb)、血小板(plt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶原指数(pi)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、尿素、钠(na)、糖血、甘油三酯、白蛋白(alb)、碱性磷酸酶(alp)、人软骨糖蛋白39(ykl-40)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(timp-1)、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、铁蛋白、tgfβ1、层粘连蛋白、βγ-阻滞、结合珠蛋白、c反应性蛋白(crp)或胆固醇，优选地选自α-2巨球蛋白(α2m)、透明质酸(ha)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、β-球蛋白、血小板(plt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶原指数(pi)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、糖血、甘油三酯、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(timp-1)或βγ-阻滞，更优选地选自α-2巨球蛋白(α2m)、透明质酸(ha)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、β-球蛋白、凝血酶原指数(pi)或βγ-阻滞，
-复生物变量，例如ast/alt，
-临床变量，其选自首次接触的年龄“开始年龄”、年龄、诱因持续时间、性别、肝质硬、脾大、腹水、侧支循环、cld的诱因或食管静脉曲张(ev级)，优选地选自首次接触的年龄、年龄、诱因持续时间、性别或cld的诱因，
-评分，其选自metavirf阶段、纤维化面积(aof)、纤维化评分(例如fibrometertm、fibrotesttm、fibrospecttm、fibroscantm，优选fibrometertm)、pga评分、pgaa评分、肝硬化评分(hepascore)、天冬氨酸转氨酶与血小板比率指数(apri)或欧洲肝纤维化(elf)，以及
-它们的任何组合，
b)在数学函数中组合选定的变量，所述数学函数选自下列：多线性回归函数、非线性回归函数或简单数学函数，例如诸如除法的算术运算。
根据优选实施例，所述方法包括组合至少两个生物变量或至少两个评分和选自诱因持续时间(尤其是慢性肝病持续时间)和首次接触诱因的年龄(也被称为“开始年龄”)的至少一个临床变量。
优选地，所述至少一个临床变量是诱因持续时间。备选地，所述至少一个临床变量是首次接触诱因的年龄(“开始年龄”)。优选地，所述方法包括两个临床变量。根据优选实施例，所述两个临床变量是诱因持续时间和开始年龄。
有利地，所述至少一个评分选自由下列构成的组：纤维化面积(aof)和/或纤维化评分和/或分形维数。
根据本发明的第一实施例，通过测量metavirf进展来评估肝纤维化进展，确定所述metavirf进展是通过测量以下：
-生物变量，其选自iii型前胶原n端前肽(p3p)、透明质酸(ha)、凝血酶原指数(pi)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)或βγ-阻滞，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自首次接触的年龄、诱因持续时间，
-评分，其选自metavirf阶段、纤维化面积(aof)、pga评分、pgaa评分或fibrometertm，以及
-它们的任何组合，并且
在数学函数中组合选定的变量，所述数学函数选自由下列构成的组：多线性回归函数、非线性回归函数或简单数学函数，例如诸如除法的算术运算。
在该实施例中，优选地，不选择变量性别。
在该实施例中，根据第一目的，所述变量是：
-生物变量凝血酶原指数(pi)，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量诱因持续时间，
-评分metavirf阶段，以及
-它们的任何组合。
在该实施例中，根据第二目的，所述变量是：
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自诱因持续时间或首次接触的年龄，
-评分fibrometertm，以及
-它们的任何组合。
在该实施例中，根据第三目的，所述变量是：
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自诱因持续时间，以及
-它们的任何组合。
根据本发明的第二实施例，通过测量纤维化面积(aof)进展来评估肝纤维化进展，确定所述aof进展是通过测量以下：
-生物变量，其选自α-2巨球蛋白(α2m)、透明质酸(ha)、β-球蛋白、凝血酶原指数(pi)或βγ-阻滞，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自首次接触的年龄、年龄、诱因持续时间、性别、肝质硬、脾大、腹水、侧支循环或cld的诱因，
-评分，其选自metavirf阶段、纤维化面积(aof)、fibrometertm、pga评分或pgaa评分，以及
-它们的任何组合，并且
在数学函数中组合选定的变量，所述数学函数选自由下列构成的组：多线性回归函数、非线性回归函数或简单数学函数，例如诸如除法的算术运算。
在该第二实施例中，根据第一目的，所述变量是：
-生物变量β-球蛋白，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量诱因持续时间，
-评分纤维化面积(aof)，以及
-它们的任何组合。
在该第二实施例中，根据第二目的，所述变量是：
-生物变量β-球蛋白，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量诱因持续时间，
-评分metavirf阶段，以及
-它们的任何组合。
在该第二实施例中，根据第三目的，所述变量是：
-生物变量，其选自β-球蛋白或凝血酶原指数(pi)，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自诱因持续时间或肝质硬，以及
-它们的任何组合。
在该第二实施例中，根据第四目的，所述变量是：
-生物变量，其选自β-球蛋白或凝血酶原指数(pi)，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自首次接触的年龄、诱因持续时间或肝质硬，以及
-它们的任何组合。
在该第二实施例中，根据第四目的，所述变量是：
-生物变量，其选自β-球蛋白或α-2巨球蛋白(α2m)，
-复生物变量ast/alt，
-临床变量，其选自首次接触的年龄或诱因持续时间，以及
-它们的任何组合。
根据特定实施例，本发明的非侵入方法包括以规则的时间间隔(例如每10天、每月或每年)测量的至少两个纤维化评分。
根据本发明，个体可能处于患有状况的风险中或正患有状况，所述状况选自由下列构成的组：慢性肝病、肝炎病毒感染、肝中毒、肝癌、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、自身免疫性疾病、代谢性肝病和肝的继发性累及疾病。
肝炎病毒感染可以由病毒引起，所述病毒选自由下列构成的组：丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒。肝中毒可以是酒精引起的肝中毒和/或药物引起的肝中毒(即，诸如酒精或药物的任何外源物)。根据本发明，自身免疫性疾病选自由下列构成的组：自身免疫性肝炎(aih)、原发性胆汁性肝硬化(pbc)和原发性硬化性胆管炎(psc)。代谢性肝病可以选自由下列构成的组：血色病、威尔森氏(wilson’s)病和α1抗胰蛋白酶。肝的继发性累及可以是乳糜泻或淀粉样变。
一旦参考附图阅读了作为例子给出的本发明的优选实施例的以下非限定性描述，本发明的其他目的、优点和特征就会变得更加显而易见。
附图说明
图1a表示metavir分类，其将肝纤维化分类为从f0至f4的五个阶段。
针对例子1阅读图1b-7。
图1b是显示作为metavir纤维化(f)阶段函数的metavirf和纤维化面积(rs＝0.77，rp＝0.90，p<10-4)之间的进展速度的相关性的图形。rs是斯皮尔曼(spearman)相关系数；rp是皮尔森(pearson)相关系数。
图2是显示作为metavirf阶段函数的纤维化进展速度的图形。metavirf(f)或纤维化面积(aof)的进展速度与metavirf阶段相关(分别地，rs＝0.58，p<10-4，rs＝0.49，p<10-4)并且随着metavirf级明显不同(分别地，anova：p<10-4，p＝0.001)。
图3a是显示酒精性和病毒性慢性肝病(cld)中的metavirf的纤维化进展速度的图形。绘制转移线仅仅是为了显示患者群之间的差异。
图3b是显示酒精性和病毒性慢性肝病(cld)中的aof的纤维化进展速度的图形。绘制转移线仅仅是为了显示患者群之间的差异。
图4是显示根据cld诱因(酒精性以黑色表示并且病毒性以灰色表示)和根据metavirf阶段作为诱因持续时间函数的aof的图形。
图5是根据metavir纤维化(f)阶段作为诱因持续时间函数的aof进展速度。曲线按照定义具有倒数形状(1/x)。
图6a是纤维化进展速度、metavir纤维化阶段和首次接触的年龄之间的关系。线由多项式回归提供。
图6b是纤维化进展速度、aof和首次接触的年龄之间的关系。线由多项式回归提供。aof进展的轴线在3被截顶。
图7是抗纤维化治疗对纤维化面积和metavirf阶段的影响。盒形图指示中值、四分位值和极值。
针对例子2阅读图8-16。
图8是显示在例子2的群体1(画面a)和2(画面b)中metavir纤维化(f)阶段和纤维化面积(aof)进展之间的相关性的图形。线描绘线性回归。
图9是显示在群体1(顶部画面)和2(底部画面)中，在诱因持续时间期间作为在包含年龄的metavir纤维化(f)阶段函数的metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积(aof)进展(右画面)之间的关系的图形。
图10是显示在群体1(顶部画面，仅仅酒精性cld)和2(底部画面，病毒性cld)中metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积(aof)进展(右画面)和各自的预测进展之间的相关性的图形。
图11显示了在群体1(顶部画面)和2(底部画面)中metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积(aof)(右画面)和诱因持续时间之间的关系。曲线描绘lowess回归。
图12显示了在群体1(顶部画面)和2(底部画面)中metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积(aof)(右画面)进展和开始年龄之间的关系。曲线描绘lowess回归。
图13显示了在群体1(顶部画面)和2(底部画面)中metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积(aof)(右画面)和开始年龄之间的关系。曲线描绘lowess回归。
图14显示了在群体1(顶部画面)和2(底部画面)中metavir纤维化(f)阶段(左画面)或纤维化面积进展(中间画面)或纤维化面积(右画面)和包含年龄之间的关系。曲线描绘lowess回归。
图15显示了在群体2中纤维化特性和诱因持续时间之间的关系，显示了取决于纤维化进展的不同纤维化者。曲线描绘lowess回归。
图16显示了在群体2中特定患者子组对取决于不同时间的metavir纤维化(f)阶段的曲线的影响。根据图11a中所示的方法确定影响。
具体实施方式
例子1
方法
1.患者
群体
包括在该研究中的所有201个患者由位于法国昂热市(angers)的大学(university)医院的肝胃肠科接收。根据接触(或暴露于)cld的风险因素(或诱因)的日期的估计的可用性来选择185个患者的第一群体(其全部已受到一次肝活检)。包含日期和接触日期之间的时间差在本文中被称为“诱因持续时间”。选择16个患者的第二群体(其全部已受到两次肝活检)。
群体1
包括在该群体中的185个患者由于酒精性肝病或由于慢性病毒性乙型或丙型肝炎而被接收。包括在过去的五年中每天饮酒精至少50g或血清乙型肝炎表面抗原或丙型抗体为阳性的患者。没有患者具有慢性肝病的其他诱因(威尔森氏(wilson’s)病、血色病、α1抗胰蛋白酶缺乏、胆道疾病、自身免疫性肝炎、肝细胞性肝癌)的临床、生物、回波描记或组织学证据。在入院时获取血液样本并且在一周内执行经肋(吸引针)或经颈静脉(切割针)肝活检。
这些患者可能具有肝代偿失调和不同的cld诱因。实际上，诱因持续时间仅仅在179个患者中被记录，而在具有metavirf阶段0的其他6个患者中，metavirf进展的速度可以按照定义固定在0。然而，由于26个患者中的样本碎裂，纤维化面积仅仅在153个患者中被测量，而进展速度在具有metavirf阶段0的6个患者中是不固定的，原因是基线纤维化面积不为零。在病毒性cld中根据首次输血或药物滥用的记录并且在酒精性cld中根据长期过量酒精摄入的首次日期来估计首次暴露的日期。该群体允许计算纤维化的估计进展速度。另外，进展的解释变量后验地记录。
群体2
这16个患者具有两次肝活检、具有不同的cld诱因并且10个患者在两次活检之间受到推断的抗纤维化治疗，例如干扰素和沙坦(sartan)。该群体允许测量纤维化的观察进展速度。另外，进展的解释变量先验地记录，因此是真实的预测因数。
2.临床评价
由高级医生执行全面临床检查。记录变量是：年龄、首次接触肝病的诱因的年龄(仅仅对于酒精性患者和归因于输血和药物滥用的丙型肝炎可用)、性别、身高、体重(在最后穿刺术之前)、在最后戒断之前的平均酒精消耗(g/d)、酒精滥用的持续时间、酒精戒断、酒精戒断的持续时间、肝病的已知持续时间(从cld的首次临床或生物化学异常提示开始)、肝功能评分和其他临床异常。群体1也受到上胃肠道内窥镜检查以评价门静脉高压的体征并且受到肝多普勒超声波检查。
3.血液试验
血液样本的分析提供以下测量：血红蛋白、红细胞平均容积、淋巴细胞计数、血小板计数、胆固醇、尿素、肌酸酐、钠(na)、胆红素、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)、白蛋白(alb)、α1和α2球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、βγ-阻滞、凝血酶原指数(pi)、载脂蛋白a1(apoa1)。它们中的一些是纤维化的间接血液指标(1)。
用于该研究中的纤维化的直接血液指标如下：α-2巨球蛋白(a2m)、iii型前胶原n端前肽(p3p)、透明质酸(ha)、tgfβ1和层粘连蛋白。计算如下的血液试验：ast/alt比率、pga评分(2)、pgaa评分(3)、apri(4)、不同的纤维测定器(5)和肝硬化评分(hepascore)(6)。血清在-80℃下最多保持48个月供化验。
4.肝组织学评估
显微分析
活检样品固定在福尔马林-酒精-乙酸溶液中并且嵌入石蜡中；5μm厚的切片用苏木精-曙红-番红花和0.1％苦味酸天狼猩红(picrosiriusred)溶液染色。纤维化由两个独立的病理学家根据metavir分段进行分段(7)。metavir分段也很好地适合于酒精性cld中的纤维化的半定量评价，原因是肝门-中隔纤维化比小叶中心部分纤维化更常见和显著(8)。观察者无视患者特性。当病理学家意见不一致时，样品在双头显微镜下被重新检查以分析差异并且达成一致意见。所有样品也根据以下面的等级评价：metavir活性(7)、脂肪变性和小叶中心部分纤维化(clf)，如先前所述(9)。
图像分析
使用leicaquantimetq570图像处理器在与显微分析相同的切片上测量aof，如先前所述(9)。也在群体2中测量纤维化的分形维数(10)。
5.观察者
总共有在教学医院工作的2个病理学家，1个是高级专家，1个是初级专家。由在该技术中有经验的初级专家病理学家执行图像分析。
6.统计分析
除非另外指出，定量变量被表达为平均值±sd。皮尔森等级相关系数(rp)或必要时斯皮尔曼相关系数(rs)用于连续变量之间的相关。为了评估独立预测因素，用于定量因变量的多线性回归和用于定量因变量的二元逻辑回归用于变量的向前逐步增加。每个模型的预测性能由经调节的r2系数(ar2)和由诊断精度(即，相应地，真阳性和阴性)表达。双侧试验的α风险<5％被认为是统计显著的。所使用的统计软件是11.5.1版spss(美国，伊利诺伊州芝加哥市，spss公司)。
7.数学函数的例子
根据以下公式由多线性回归提供进展速度(pr)的估计：pr＝a0+a1x1+a2x2+…，其中ax是指标或变量xx的系数并且a0是常数。
纤维化面积的pr的公式的例子是包括ast/alt、诱因持续时间、肝质硬、β-球蛋白和fibrometertm的预测模型，其中系数如下：
常数：-0.0978158087539，具有在95％的置信区间范围：0.8363614252041&-1.035103236918；
ast/alt：0.5412244415007，具有在95％的置信区间范围：2.07804027617.e-006&0.3283727153579；
诱因持续时间：-0.07623687627859，具有在95％的置信区间范围：5.016575306101.e-011&-0.09671608407235；
肝质硬：0.7172332316927，具有在95％的置信区间范围：0.006563850544752&0.2047931685256；
β-球蛋白：0.1594071294621，具有在95％的置信区间范围：0.001915414369681&0.06022006972876；
fibrometertm：1.15299980586，具有在95％的置信区间范围：0.002487655344947&0.4161078148282。
结果
1.一般特性
在表1中呈现了不同群体的一般特性。
表1：群体的主要特性
2.纤维化进展的主要特性
在群体1中计算纤维化进展。进展速度以metavir单位(mu)每年表达，对于metavirf范围为0至2.0mu/年(mu/yr)(平均值：0.22±0.29，中值：0.13)并且对于纤维化面积范围为0.1至17.2％/yr(平均值：1.8±2.6，中值：1.0)。
两个纤维化进展速度高度相关(图1b)。纤维化的进展速度随着纤维化f阶段增加(图2)。然后我们测试与纤维化进展联系的其他因数。
3.纤维化进展的预测因数
metavirf进展
观察到metavirf进展与metavirf阶段(r＝0.33，p<10-4)、纤维化面积(r＝0.28，p<10-4)、首次接触的年龄(r＝0.46)、诱因持续时间(r＝-0.48，p<10-4)、p3p(r＝0.26，p<10-4)、ha(r＝0.27，p<10-4)、pi(r＝-0.22，p<10-4)、ggt(r＝0.32，p<10-4)、ast/alt(r＝0.38，p<10-4)、fibrometertm(r＝0.27，p<10-4)、pga评分(r＝0.27，p<10-4)和pgaa评分(r＝0.28，p<10-4)的最显著相关。观察到与定量变量仅有的重要联系：βγ阻滞(p＝0.03)和性别(p＝0.001)。
使用线性回归，metavirf进展的独立预测因素是：ast/alt、诱因持续时间、metavirf阶段和pi(ar2＝0.605)。cld诱因不具有独立作用(p＝0.63)。如果metavirf阶段被去除，则在预测模型中没有病理变量：诱因持续时间、ast/alt、首次接触的年龄和fibrometertm(ar2＝0.488)。应当注意“首次接触的年龄”+“诱因持续时间”＝年龄，然而如果前两者被去除，则不选择后者，而使用ast/alt和性别ar2减小到0.195。
纤维化面积进展
观察到纤维化面积进展与metavirf阶段(r＝0.32，p<10-4)、纤维化面积(r＝0.41，p<10-4)、首次接触的年龄(r＝0.43)、诱因持续时间(r＝-0.43，p<10-4)、ha(r＝0.34，p<10-4)、pi(r＝-0.24，p<10-4)、β-球蛋白(r＝0.32，p<10-4)、ast/alt(r＝0.51，p<10-4)、fibrometertm(r＝0.29，p<10-4)、pga评分(r＝0.29，p<10-4)和pgaa评分(r＝0.30，p<10-4)的最显著相关。观察到与定量变量的若干重要联系：βγ阻滞(p＝0.04)、性别(p＝0.004)、肝质硬(p＝0.04)、脾大(p＝0.02)、腹水(p＝0.001)、ev级(p＝0.04)、侧支循环(p＝0.001)和cld的诱因(p＝0.03)。
使用线性回归，纤维化面积进展的独立预测因素是：ast/alt、诱因持续时间、纤维化面积和β-球蛋白(ar2＝0.716)。应当注意脂肪变性具有边线重要性(p＝0.057)但是不具有活性(p＝0.53)和cld诱因(p＝0.39)。如果纤维化面积被去除，则metavirf阶段在模型中取代它(ar2＝0.689)并且如果metavirf阶段被去除，即，没有任何病理变量，则预测模型包括ast/alt、诱因持续时间、肝质硬、β-球蛋白和pi(ar2＝0.643)。如果“诱因持续时间”被去除，则“首次接触的年龄”在模型中取代它(ar2＝0.643)并且如果“首次接触的年龄”阶段被去除，则模型包括客观变量：ast/alt、年龄、β-球蛋白和a2m，具有ar2＝0.509。
4.纤维化进展的动力学
估计的进展(群体1)
图3a和图3b显示了纤维化速度随着metavirf阶段逐步、但不规则增加。正如所料，与纤维化面积相比metavirf阶段的进展速度更多地与f阶段联系，这也由相关系数反映(对应地，rs＝0.58和0.49，p<10-4)。图3a和图3b显示了纤维化面积从f阶段0至3的相当稳定的进展速度和在具有硬化的患者中的急剧增加，而对于metavirf阶段的进展速度增加在所有f阶段中是逐渐的。
纤维化面积和诱因持续时间之间的相关是弱的(rp＝0.32，p<10-4)。实际上，图4显示了作为诱因持续时间的函数的纤维化面积在患者之间显著地变化，因此一些患者可能在短期内形成硬化并且其他患者在长时间后形成硬化。然而，具有最快速度的所有患者(正如所料)和具有最长跟进的那些患者(未曾预料)具有硬化。短诱因持续时间在硬化中是令人感到意外的，然而这主要在酒精性cld中被观察到。而且，在酒精性cld中当诱因持续时间<15yr时比≥15yr时患者年龄明显更低：45.5±8.9比55.0±10.2yr(p＝0.002)，而在病毒性cld中图是类似的：分别地，54.4±14.4比56.6±15.2yr(p＝0.81)。该图也未根据进展速度建议患者的特定组。
根据诱因持续时间绘制的aof进展的图形(图5)清楚地显示患者个体在每个f阶段内具有不同型式的纤维化面积的进展速度。实际上，先前的多变量分析指示“诱因持续时间”或“首次接触的年龄”是metavirf或纤维化面积进展的主要临床独立预测因素。图6a和图6b显示了在病毒性和酒精性cld中f进展急剧增加40年。然而，在酒精性cld中aof进展显示随之年龄线性增加，而在病毒性cld中在线性增加40年之后达到稳定水平。
观察的进展(群体2)
活检之间的平均时间间隔(跟进持续时间)在整个组中为4.1±2.6年，并且在未治疗的6个患者中为4.8±2.5，相比之下，在2次肝活检之间进行抗纤维化治疗的10个患者中为3.6±2.6(p＝0.38)。未治疗患者中的每年进展速度对于metavirf为：平均值：0.17±0.27，中值：0.09mu，并且对于纤维化面积为：平均值：1.3±3.4，中值：1.2％。这些值明显不同于那些估计值(对于f，p＝0.66，并且对于aof，p＝0.72)。
aof比metavirf远远更敏感地用于检测抗纤维化治疗的影响：aof的百分比变化：p＝0.03，aof的进展速度：p＝0.09；f阶段的百分比变化：p＝0.85，f阶段的进展速度：p＝0.71(通过曼-惠特尼(mann-whitney)试验，图10)或f阶段增加的比例：p＝0.61(通过麦克尼马尔(mcnemar)χ2试验)。
例子2
纤维化进展被计算为纤维化水平/诱因持续时间的比率，其中纤维化水平指示阶段或量aof。因此，这是作为时间的函数的平均值。由于主要目标是精确地描述纤维化进展，通过由aof反映的纤维化量，我们使用lb作为纤维化水平确定基准并且我们为非侵入诊断选择可以评价纤维化分段和aof的血液试验(14)。为了时间记录，我们使用纤维化进展的两个描述因素：进展速度和进展过程。进展速度是作为诱因持续时间的函数的平均值，诱因持续时间是诱因开始时的年龄(“开始年龄”)和包含测量纤维化水平时的年龄(“包含年龄”)之间的时间。进展过程是一种随着时间的趋势(增加、稳定、减小)。因此，根据用于纤维化确定(lb或非侵入试验)和持续时间记录(回溯/横向或预期/纵向)的方法，我们区分计算纤维化进展的4种方法。在表2中详述了它们的特性、优点和限制。由于这些方法的可获得性随着时间显著地变化，我们必须通过将不同的群体收集在我们的数据库中来间接地比较它们。
患者
群体目标(表3)
使用包括1456个患者的5个群体。包括在该研究中的所有患者由位于法国昂热市(angers)的大学医院的肝胃肠科接收，在别处描述的群体3除外(15)。
根据诱因开始时的年龄(“开始年龄”)的估计的可用性来选择群体1和2。开始年龄和包含测量纤维化水平时的年龄(“包含年龄”)之间的时期被称为“诱因持续时间”。群体1提供酒精性和病毒性cld之间的比较。具有病毒性cld的群体2具有足够多数量的患者来验证先前的病毒性子群体并且允许子组分析。群体3是具有病毒性cld的大群体，提供包含年龄影响的验证。群体4允许在具有2lb的患者中验证用1lb估计的先前进展。最后，群体5用于验证用两个血液试验计算的进展。
群体特性(表4)
群体1－它包括在1994到1996之间具有酒精性cld或慢性乙型或丙型肝炎的185个患者。在别处详述该群体(16)。对于酒精性cld根据长期过量酒精摄入的首次日期并且对于病毒性cld根据首次输血或药物滥用的记录来估计首次暴露于诱因的日期。这些患者可能具有肝代偿失调。实际上，诱因开始仅仅在179个患者中被记录，而在具有metavirf阶段0的其他6个患者中，metavirf进展的速度可以按照定义固定在0。然而，由于26个患者中的样本碎裂aof仅仅在153个患者中被测量，而进展速度在具有metavirf阶段0的6个患者中是不固定的，原因是基线纤维化面积不为零。
群体2－它包括在1997到2002之间具有慢性丙型肝炎的157个患者，如别处详述(14)。平均包含年龄为43.4±12.4yr并且59.4％的患者为男性。
群体3－它包括在1997到2007之间在9个法国中心lb接收的具有丙型肝炎的1056个患者，如别处详述(15)。平均包含年龄为45.4±12.5yr并且59.6％的患者为男性。
群体4－它包括在1997到2002之间具有两个lb的cld的各种诱因和不同cld诱因的16个患者。
群体5－它包括在2004到2008之间具有慢性丙型肝炎的42个患者。每年测量血液试验持续2.4±0.5yr。
临床评价和血液试验
由高级医生执行全面的临床检查。所记录的主要临床变量为：包含年龄、开始年龄、性别和cld诱因。在别处描述其他变量(14-16)。血液样本的分析提供普通变量以及纤维化的直接血液指标以计算血液纤维化试验。因此，计算血液试验以估计纤维化阶段或aof(14)。
肝组织学评估(群体1、2和4)
显微分析－活检样本固定在福尔马林-酒精-乙酸溶液中并且嵌入石蜡中；5μm厚的切片用苏木精-曙红-番红花和0.1％苦味酸天狼猩红溶液染色。纤维化由无视患者特性的两个独立的病理学家根据metavir分段进行分段(6)。metavir分段也很好地适合于酒精性cld中的纤维化的半定量评价(17)。在意见分歧的情况下，样品在双头显微镜下被重新检查以达成一致意见。
图像分析－使用如先前所述的从1996至2006的leicaquantimetq570图像处理器(10)或使用从2007提供30,000x30,000像素和0.5μm/pixel的分辨率(放大率x20)的高质量图像的aperio数字载玻片扫描器(
观察者－总共有在教学医院工作的2个病理学家，1个是高级专家，1个是初级专家。由在该技术中有经验的初级专家病理学家(17)或由全自动系统的工程师执行图像分析。
统计分析
除非另外指出，定量变量被表达为平均值±sd。皮尔森等级相关系数(rp)或必要时斯皮尔曼相关系数(rs)用于连续变量之间的相关。加权最小二乘方的lowess回归用于确定变量之间的关系的平均趋势，主要是进展过程(18)。在这些曲线中观察到的线断裂由根据最大约登(youden)指数和诊断精度(未显示的数据)确定的截止点检验。曲线形状由相应的测试(例如二次趋势测试)评价。为了评估独立预测因素，用于定量因变量的多线性回归、用于定量因变量的二元逻辑回归和用于有序变量的判别分析用于变量的向前逐步增加。每个模型的预测由经调节的r2系数(ar2)和/或由诊断精度(即，分别地，真阳性和阴性)表达。双侧试验的α风险<5％被认为是统计显著的。所使用的统计软件是11.5.1版spss(美国，伊利诺伊州芝加哥市，spss公司)。
结果
一般特性
在表4中呈现了核心群体1和2的一般特性。在群体1中，在基线(包含)处的变量在酒精性和病毒性诱因之间明显不同，开始年龄除外。基线变量在病毒性群体1和2之间不明显不同。应当注意开始年龄在群体之间是类似的，而包含年龄在归咎于更长的诱因暴露的酒精性cld中明显更大。
纤维化进展的总体描述
回溯测量
群体1－以metavir单位(mu)每年表达的进展，对于metavirf范围为0至2.0mu/yr(平均值：0.22±0.29，中值：0.13)并且对于aof范围为0.1至17.2％/yr(平均值：1.8±2.6，中值：1.0)。两个纤维化进展速度高度相关(rp＝0.90，p<10-4，图8a)。纤维化进展随着纤维化f阶段而增加(图9a和9b)。aof进展在酒精性cld中比在病毒性cld中明显更快，但是在metavirf中不是这样(表4)。
群体2－以metavir单位(mu)每年表达的进展速度，对于metavirf范围为0至0.8mu/yr(平均值：0.16±0.14，中值：0.11)并且对于aof范围为0.2至4.5％/yr(平均值：0.8±0.7，中值：0.6)。aof和f进展也很好地相关rp：0.795(p<10-3)(图8b)。根据f阶段纤维化进展明显不同(anova，p<10-3)(图9c和9d)。通过邦弗朗尼(bonferroni)事后比较，对于f进展，进展在每个f阶段之间明显不同(f2和f3之间除外)，但是对于aof进展，仅仅在f4与f1和f3之间明显不同。
作为性别函数的比较(表4)－在酒精性患者中，包含时的f或aof在女性和男性之间无明显不同，但是女性中的诱因持续时间明显比男性短。因此在酒精性cld中f或aof进展在女性中比在男性中明显更快。群体2中的包含时的f或aof在男性中比在女性中明显更高，但是诱因持续时间在男性和女性之间无明显不同。因此，并且与酒精性cld相反地，在病毒性cld中f或aof进展在男性中比在女性中明显更快(在数目更多的群体2中明显)。
作为诱因函数的比较(表5)－仅仅在女性中，f和aof进展在酒精性cld中比在病毒性cld中急剧地和显著地增加。
病毒性群体之间的比较－aof进展在群体1中比在群体2中明显更高(表4)；这可以是由于aof技术的差异，原因是aof在群体中明显不同，或者可以是由于群体的差异，原因是f进展往往是不同的。
预期测量
群体4－活检之间的平均间隔时间(跟进持续时间)为4.1±2.6年。每年进展速度对于metavirf为：平均值：0.17±0.27，中值：0.09mu，并且对于纤维化面积为：平均值：1.3±3.4，中值：1.2％。这些值明显不同于群体1中的那些估计值(对于f，p＝0.481，并且对于aof，p＝0.567)。
纤维化进展的过程
我们根据与时间联系的三个变量描述由lowess回归的绘图反映的纤维化进展的过程的平均趋势，所述三个变量为：诱因持续时间、诱因开始时的年龄和包含时的年龄(其是前两者的和)。由于酒精性cld，诱因开始时的年龄与群体1中的诱因持续时间相关(rp＝-0.449,p<10-4)，但是在群体2中不是这样(rp＝-0.084p＝0.319)。必须谨慎地解释绘图的极值的特定趋势，原因是这可能是由于与较少患者联系的减小鲁棒性。
诱因持续时间－在群体1中，诱因持续时间与纤维化水平弱相关：f阶段：rs＝0.357,p<10-3(图11a)，aof：rs＝0.316,p<10-3(图11b)。在群体2中，诱因持续时间与f阶段(rs:0.241,p＝0.004)(图11c)或aof(rs:0.201,p＝0.018)弱相关，所述f阶段或aof在男性和女性中具有相同的过程(图11c和11d)。所有这些图显示第一个15年中的意外减小和其后的逐渐增加。
开始年龄－图12a显示了在酒精性(≈40年)和病毒性(≈30年)cld中f进展急剧地增加开始年龄的30-40年(群体1)。后一个图在群体2中尤其在男性中被确认(图12c)。这导致在病毒性cld中f阶段随着开始年龄逐渐增加(图13c)，但是这未在酒精性cld中(图13a)或在具有病毒性cld的年轻患者中被观察到(下面解释)。然而，aof进展在酒精性cld中显示随着开始年龄的几乎线性增加，而在病毒性cld中在开始年龄线性增加≈40年之后达到稳定水平(群体1)(图12b)。这在群体2中尤其在男性中被确认(图12d)。总体上，在群体1(图13b)和2(图13d)中aof作为开始年龄的函数是相对稳定的。然而，存在一些异常：在f阶段(图13c)或aof(图13d)中在具有病毒性cld的男性中的第一个20年中的缓漫减小以及在女性中的开始年龄减小40年(图13d)。
包含年龄－考虑f进展，在酒精性cld中存在稳定的进展直到50yr(图14a)，然后减小，而在病毒性cld中在开始减小低于35yr之后，尤其在男性中，其后存在增加(图14a和14d)。考虑f水平，增加在酒精性cld中随着年龄是线性的，并且在病毒性cld中发生40-50yr(图15a)。群体2和3表明在病毒性cld中该增加在男性中发生40yr并且在女性中发生50yr(图15b和15c)。在病毒性cld中存在初始的f下降(图15a)，尤其在男性中(图15b)，这未在群体3中被确认(图15c)，但是在该后一个群体中存在更年轻的患者(由较老的年龄反映：p＝0.06)。
aof进展在酒精性cld中不取决于包含年龄(图14b)，而在病毒性cld中存在后期增加(图14b和14e)。因此，在酒精性cld中aof水平随着年龄线性地增加(图14c)，而在病毒性cld中这发生50yr(图14f)。
性别－我们在这里声明性别和cld诱因之间的特殊关系，原因是性别影响已经在病毒性cld中被提及。然而在病毒性cld中在男性和女性之间存在总体对应，在酒精性cld中女性具有两个特殊性：30-50yr之间的减速和开始年龄的50yr的纤维化进展和水平的后期增加(数据未显示)。对于包含年龄观察到相同的差异，区别在于正如预料，在以后的45-50yr之间观察到减速。
至硬化的时间
在群体1中，至硬化的时间在酒精性cld中为24.7±13.3yr，相比之下在病毒性cld中为22.1±15.9yr(p＝0.495)，并且在酒精性cld中在男性中为28.0±12.5yr，相比之下在女性中为16.1±11.4yr(p＝0.001)。在(病毒性)群体2中，它在男性中为17.0±8.0yr，相比之下在女性中为24.0±10.0yr(p＝0.017)。
非侵入评价
观察到的fibrometertm进展[(fibrometertmt2-fibrometertmt1)/(t2-t1)]在群体5中为0.049±0.058/yr，而估计的fibrometertm进展(fibrometertmt2/诱因持续时间)在群体2中为0.038±0.033/yr(p＝0.217)。
识别纤维化者的类别
在群体2中，有可能取决于aof进展(图15b)而不是f进展(图15a)区分纤维化者的三个类别。截止点为0.58和1.36％/yr，区分慢(52.5％)、中(34.5％)和快(12.9％)纤维化者，其中aof进展分别为：0.42±0.10、0.81±0.21和2.43±0.81％/yr(p<10-3)。由aof进展限定的纤维化者符合f进展：0.09±0.06、0.15±0.06和0.43±0.18mu/yr(p<10-3)，分别对应慢、中和快纤维化者(图15c)。开始年龄随着纤维化者程度而增加：分别地，25.2±10.5、28.7±10.8和33.0±13.6yr(p<10-3)。女性的比例随着纤维化者程度而增加：分别地，53.4％、66.7％和77.8％(p＝0.034)。通过逐步判别分析，纤维化由metavirf、aof、f进展和诱因持续时间预测(诊断精度：91.4％)。快纤维化者通过逐步二元逻辑回归由增加的aof、较年轻的包含年龄和较年老的开始年龄预测，诊断精度为：100.0％。
表2－纤维化评价
afl是纤维化水平并且t是相应日期
b非侵入(当前研究中的血液试验)
表3.在该研究中使用的不同群体的主要特性。
a基于lb；b诱因持续时间＝包含测量肝纤维化水平时的年龄和在肝病开始时的年龄之间的时间；c限制到纤维化水平与年龄的关系绘图。
表4.群体1和2的临床特性。
a酒精性对病毒性；b对病毒性群体1
na:不适用
表5.在群体1和2中取决于性别的过程和包含时的数据。
a曼-惠特尼试验
参考文献
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尽管在上文中通过本发明的优选实施例描述了本发明，但是它可以被修改而不脱离如附带权利要求中限定的本发明的精神和本质。
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