高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法与流程

本发明涉及儿茶酚胺代谢物检测的
技术领域：
，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法。
背景技术：
：儿茶酚胺是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，包括肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)，是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。这三种儿茶酚胺都是由酪氨酸为前提转化得到的，在体内儿茶酚胺物质代谢后，被转变成相应的代谢产物如甲氧基肾上腺素(或变肾上腺素，Metanephrine，MN)、甲氧基去甲肾上腺素(或去甲变肾上腺素，Normetaneprine，NMN)、香草扁桃酸(Vanillylmandelicacid，VMA)、高香草酸(Homovanillicacid，HVA)等。儿茶酚胺及其代谢物在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织系统的生理活动中起着广泛的调节作用，同时还影响人体的代谢。甲氧肾上腺素及甲氧基去甲肾上腺素为肾上腺素及去甲肾上腺素的中间产物，特别地，被公认为是临床上诊断嗜铬细胞瘤的黄金标准，检测灵敏度和特异度均高于90％；香草扁桃酸和高香草酸结构相似，其中香草扁桃酸为肾上腺素和去甲肾上腺素的主要终末代谢产物，而高香草酸为多巴胺的终末代谢产物，神经母细胞瘤患者体内可同时分泌过量的肾上腺素、去甲肾上腺素以及多巴胺，代谢产物香草扁桃酸和高香草酸会通过肾脏排泄，在疾病早期即升高。因此同时检测儿茶酚胺代谢物，不仅可以间接反映体内儿茶酚胺的代谢情况，而且对嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等中枢神经系统疾病的早期诊断及鉴别有重要意义。目前常用的儿茶酚胺代谢物的检测方法主要有放射酶学法、化学发光法、荧光法和高效液相色谱法等，这些检测方法主要存在以下一些问题：第一，血浆样品前处理过程复杂，并且需要起始样品量较大；第二，现有检测技术过程时间长，实验误差较大，通量低；第三，由于肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素分子量一样，结构非常类似，无法用常规检测方法区分，特异性较差；第四，现有检测方法通常只能检测其中一到两种物质，无法做到高通量同时检测4种儿茶酚胺代谢物。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及一种高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法。为了达到上述目的，本发明所采用的方案是：一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法，所述方法包括以下步骤：S1样品制备：往待测样品中加入一定量的含有已知浓度内标(内标是同位素标记的待测物质)的乙腈溶液，高速离心后吸取上清液；S2衍生化反应：利用离心浓缩冷冻系统将上清液冻干后，在避光条件下，用衍生化试剂对上述样品进行衍生化反应，以提高在质谱上的信号响应信号；衍生化反应时还加入适量0.1MNa2CO3–NaHCO3缓冲溶液(pH＝11.0)，反应条件为35℃避光反应30min；S3样品前处理：将衍生化反应后的样品调节pH至7后离心，取上清液于液相色谱串联质谱上样分析；调节pH使用甲酸水溶液，离心使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min；S4液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品进行分离；优选地，液相色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25度；进样量：15μl；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相为20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液(体积比)；优选地，洗脱梯度如下：时间(min)流速(mL/min)A％B％曲线值1-0.37525-230.375251340.3505064100.310906513.50.3109066150.3752511S5串联质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式检测，根据色谱洗脱时间，设置检测窗口以及参数；优选地，质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.2kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400度，锥孔气流速：50L/h，检测为阳离子模式，多重反应监控，检测驻留时间为25ms，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、锥孔电压、碰撞能量等)如下：优选地，为了进一步缩短色谱洗脱过程，只需要把B相浓度高的时间提前，进一步缩短色谱柱平衡时间，如此可以使整个检测时间可以少于5min；步骤S4液相色谱分离的洗脱梯度如下时间(min)流速(mL/min)A％B％曲线值1-0.37525-21.50.375251330.35050643.50.310906540.310906650.3752511该方案的检测方法采用高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法，所述方法包括以下步骤：S11标准品制备：将儿茶酚胺代谢物(甲氧基肾上腺素，甲氧基去甲肾上腺素、香草基杏仁酸，高香草酸)标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标(氘代香草扁桃酸，D3-香草基杏仁酸，D3-VMA；氘代甲氧基肾上腺素，D3-甲氧基肾上腺素，D3-MN)的乙腈溶液；一般来说儿茶酚胺乙腈溶液的浓度均控制在1pmol/L～1μmol/L之间，内标的浓度为25nmol/L，高速离心后吸取上清液，进行冻干；S12衍生化反应：避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯进行衍生化反应使得4种儿茶酚胺代谢物发生化学反应，提高在质谱上的信号响应信号，衍生化反应还加入适量0.1MNa2CO3–NaHCO3缓冲溶液(pH＝11.0)，反应条件为35℃避光30min；S13样品前处理：反应完后加入甲酸水溶液把混合溶液pH调至7左右，再使用低温离心机在18000g离心力4℃下对混合溶液进行离心分离，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；S14液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对4种儿茶酚胺代谢物进行分离；优选地，液相色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25度；进样量：15μl；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相为20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液；洗脱梯度如下：时间(min)流速(mL/min)A％B％曲线值1-0.37525-230.375251340.3505064100.310906513.50.3109066150.3752511S15串联质谱检测：色谱上分离后的4种儿茶酚胺代谢物进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺代谢物，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；其中，高香草酸保留时间为5.69min，香草扁桃酸保留时间为4.87min，甲氧基肾上腺素保留时间为8.05min，甲氧基去甲肾上腺素保留时间为8.93min，内标香草扁桃酸-D3的保留时间为4.87min，甲氧基肾上腺素-D3的保留时间为8.93min。优选地，质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.2kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400度，锥孔气流速：50L/h，检测为阳离子模式，多重反应监控，检测驻留时间为25ms，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、锥孔电压、碰撞能量等)如下：S16校正方程：液相色谱上分离出的4种儿茶酚胺代谢物进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；S21待测样品处理：取血浆样本，加入含内标(氘代香草扁桃酸，D3-香草基杏仁酸，D3-VMA；氘代甲氧基肾上腺素，D3-甲氧基肾上腺素，D3-MN)的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；S22衍生化反应：避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对血浆上清液进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；S23液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对4种儿茶酚胺代谢物进行分离；优选地，液相色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25度；进样量：15μl；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相为20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液；洗脱梯度如下：时间(min)流速(mL/min)A％B％曲线值1-0.37525-230.375251340.3505064100.310906513.50.3109066150.3752511S24串联质谱检测：色谱上分离后的4种儿茶酚胺代谢物进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺代谢物，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.2kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400度，锥孔气流速：50L/h，检测为阳离子模式，多重反应监控，检测驻留时间为25ms，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、锥孔电压、碰撞能量等)如下：S25儿茶酚胺代谢物的含量计算：质谱检测得到儿茶酚胺代谢物与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺代谢物的含量。优选地，所述步骤S14和/或S23中的液相色谱分离的洗脱梯度如下：本发明的高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法具有以下优点：1)可以同时定性并精准定量人血浆中的4种儿茶酚胺代谢物，包括甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、高香草酸和香草扁桃酸；2)采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后便可使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，前处理步骤简单，并且可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；并且通过氮磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；3)采用高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。附图说明图1、本发明的检测方法的流程示意图；图2、各儿茶酚胺代谢物的色谱洗脱出峰的绝对保留时间；图3、高香草酸标准曲线；图4、香草扁桃酸标准曲线；图5、甲氧基肾上腺素标准曲线；图6、甲氧基去甲肾上腺素标准曲线。具体实施方式为了使本领域技术人员可以更好地理解本发明，从而对本发明的保护范围作出明确的限定；下面结合具体实施方式对本发明作出进一步详细的说明。4种儿茶酚胺(甲氧基肾上腺素，甲氧基去甲肾上腺素、香草基杏仁酸，高香草酸)标准品以及相应同位素标记的内标(氘代香草扁桃酸，D3-VMA，氘代甲氧基肾上腺素，D3-MN)均采购自SigmaAldrich公司。标准品和内标首先用乙腈进行溶解，然后保存在-80℃，需要进行实际样品检测时，再利用乙腈将这些内标稀释到约25nM浓度作为工作液。1.标准品制备：分别取0.3ml8个不同浓度的儿茶酚胺代谢物乙腈溶液到1.5mlEP管中，再分别加入0.9ml低温保存的含内标氘代香草扁桃酸和氘代甲氧基肾上腺素乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移1mL含内标氘代的儿茶酚胺代谢物乙腈溶液到另外一个1.5mlEP管，然后用离心浓缩冷冻系统冻干；冻干后在避光条件下，向上述1.5mlEP管加入150μl4mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和50μl0.1MpH＝11.0的Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液，旋涡混合30s，然后在35℃避光反应30min；反应完后通过加入5μl15％的甲酸水溶液把混合溶液pH调到7左右，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液100μl于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品上清液中儿茶酚胺代谢物进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；液相色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25度；进样量：15μl；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相(20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液，体积比)，B相(0.1％甲酸-乙腈溶液，体积比)；洗脱梯度如下所示：3.质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的4种儿茶酚胺代谢物进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺代谢物的含量，并画制标准曲线图；色谱上分离后的4种儿茶酚胺代谢物进入到WatersXevoTQD质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺代谢物，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；香草扁桃酸保留时间为4.88min，高香草酸保留时间为5.69min，甲氧基肾上腺素保留时间为8.05min，甲氧基去甲肾上腺素保留时间为8.93min，内标香草扁桃酸-D3保留时间为4.88min，内标甲氧基肾上腺素-D3保留时间为8.05min。如图2所示，样品通过超高压液相色谱分离后，不同的儿茶酚胺代谢物质在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从上到下检测到的物质分别为：D3-甲氧基肾上腺素，甲氧基肾上腺素，甲氧基去甲肾上腺素，高香草酸，香草扁桃酸以及D3-香草扁桃酸。质谱为WatersXevoTQDIVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.2kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400度，锥孔气流速：50L/h，检测为阳离子模式，多重反应监控，检测驻留时间为25ms，每个待测物的特定反应离子对、锥孔电压、碰撞能量等，如下表所示(不同类型仪器，碰撞能量、锥孔电压值有所不同，需要独立优化)：质谱多重反应监控参数如下：多重反应监控通过两次筛选，即第一个四级杆进行特定母离子筛选，第二个四级杆进行母离子碎裂产生子离子，第三个四级杆进行特定子离子筛选，具有非常好的检测特异性。可以通过选择反应监控检测到的离子流，以及对应的保留时间，来确定儿茶酚胺代谢物的检测，再利用添加已知量的香草扁桃酸内标和甲氧基肾上腺素内标进行定量。表1HVA标准曲线实验数据表2VMA标准曲线实验数据表3MN标准曲线实验数据表4NMN标准曲线实验数据表1-表4是儿茶酚胺代谢物的实验数据，标准曲线图见图3、图4、图5、图6；检测限定义为信噪比>3，定量限定义为信噪比>10，保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间，所有检测物质的相关系数R2均>0.99，每种儿茶酚胺的保留时间，检出限，定量限，线性范围以及定量校正方程分别如图中所示；通过三日的精密度测试，包括低、中、高三个浓度，日内日间精密度RSD均小于15％，表明检测结果准确，可重复。4种儿茶酚胺代谢物的保留时间、检测限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数如下：表5儿茶酚胺代谢物保留时间及线性范围总结4.血浆中儿茶酚胺代谢物的检测：取0.3ml血浆样品到1.5mlEP管中，再加入0.9ml低温保存的含内标氘代香草扁桃酸和氘代甲氧基肾上腺素乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移1mL含内标氘代香草扁桃酸的儿茶酚胺乙腈溶液到另外一个1.5mlEP管，然后用真空冷冻干燥器冻干；冻干后在避光条件下，向上述1.5mlEP管加入150μl4mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和50μl0.1MpH＝11.0的Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液，旋涡混合30s，然后在35℃避光反应30min；反应完后通过加入5μl15％的甲酸水溶液把混合溶液pH调到7左右，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液100μl于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到儿茶酚胺代谢物与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺代谢物的含量。本发明利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法创新型的应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行儿茶酚胺的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；通过丹磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血浆中包括甲氧基肾上腺素，甲氧基去甲肾上腺素，高香草酸，香草扁桃酸等4种儿茶酚胺代谢物，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。在本发明的某些优选实施例中，色谱洗脱条件可以进一步缩短，只需要把B相浓度高的时间提前，进一步缩短色谱柱平衡时间，从而使整体检测时间可以少于5min，洗脱条件如下：时间(min)流速(mL/min)A％B％曲线值1-0.37525-21.50.375251330.35050643.50.310906540.310906650.3752511以上对本发明实施例所提供的高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明实施例的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。当前第1页1 2 3