一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中多组分含量的方法与流程

本发明涉及药物检测领域，更具体地说，本发明涉及一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中多组分含量的高效液相色谱检测方法。

背景技术：

银杏是地球上最古老的植物之一，为银杏科银杏属植物，该树种生命力极强，上千年的树龄并不罕见，堪称植物界的“老寿星”。《本草纲目》中记载，银杏叶可补心养气，益肾润肺，健脑醒神，延年益寿。现代药理学研究表明，银杏叶具有清除氧自由基、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏等作用。因而用银杏叶研制开发的制剂品种越来越多，临床应用越来越广泛。目前在临床上应用的有斯泰隆、金纳多、天保宁、银可络、舒血宁、络欣通，冠心酮等多种品牌的片剂、颗粒剂、注射剂，主要用于治疗各种心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和呼吸系统疾病等。随着对银杏叶制剂作用的研究，银杏叶的各种制剂不仅在心脑血管疾病治疗上得到了大家认可和应用，而且临床也在慢性阻塞性肺疾病等其他疾病中进行应用。随着研究的深入，银杏叶制剂将会在临床上得到更广泛的应用。

银杏叶提取物及其制剂中主要有效成分为黄酮苷类和萜类内酯活性物质，到目前为止，国内外关于银杏叶及其制剂的质量控制方法普遍是测定这两类成分的含量。关于银杏叶及其制剂中黄酮苷类和萜类内酯含量测定方法，已经有高效液相色谱法。例如，CN104034826提供了一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测银杏叶萜类内酯的方法，采用该方法可以同时检测4种萜类内酯；刘会等公开了一种以HPLC-UV法测定银杏叶提取物中3个黄酮醇苷含量，并以HPLC-ELSD法测定4个萜类内酯含量的方法(中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年2月第30卷第2期，第598～601页)。上述方法是采用不同的检测方法分别检测萜类内酯和黄酮醇苷，缺点是需要采用不同的仪器、不同的样品处理条件分别进样，从而导致操作步骤繁杂，工艺简便性不足。

崔大明等公开了一种采用RP-HPLC测定银杏叶提取物类脂质体中的3种银杏黄酮苷(槲皮素、山奈素、异鼠李素)以及4种萜类内酯(银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯)含量的方法(吉林农业大学学报，2013，35(4):446～449，462)；任艳平等公开了一种采用HPLC－MS同时测定舒血宁注射液中银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)、白果内酯、(BB)以及槲皮素(QCT)、异鼠李素(ISR)和山柰酚(KAE)等7个成分含量的方法(药物分析杂志，2013，33(2)第220～224页)。上述方法能够同时检测黄酮苷和萜类内酯，大大简化了操作流程。

在上述的众多检测方法中同时测定多种成分含量时需用到每一种成分的对照品，这样会让多指标综合质量控制在实际生产和检测工作中会因检测成本过高而使质量控制指标减少，不利于药材质量的全面评价。由此可见，尝试引入一测多评方法以实现各类成分的同时检测是规范和完善银杏叶制剂的质量控制的必备之选。

张方等公开了一种“一测多评法同时测定舒血宁注射液中6中黄酮类成分”(《中国药师》，2015年第18卷第10期，1652～1656页)的方法；杨艳模等公开了一测多评技术在银杏叶提取物及其金鸡制剂中的应用研究(湖南中医药大学硕士学位论文，2014年)。但是，上述两种方法的可检测的组分较少，且不能同时检测黄酮类和酚酸类成分，因此有必要进行更深入研究，开发更好的检测技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中14种黄酮苷类组分和2种酚酸类组分含量的检测方法。使用这种方法，可以更好的控制制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好地指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能够全面认识产品质地。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种采用高效液相色谱法同时测定银杏叶、银杏叶提取物及其制剂中黄酮苷类和酚酸类组分含量的方法，其中所述制剂不包括舒血宁注射液，该法采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；柱温33℃～37℃；洗脱流速为0.1～0.5mL/min；流动相A是含质量比为0.1％的甲酸的水溶液；流动相B是甲醇和乙腈的混合溶剂，体积比是1：1；进行梯度洗脱，梯度条件为：

采用二极管阵列检测器，采用270nm～290nm范围内的紫外波长检测酚酸类组分，并同时采用350nm～370nm范围内的紫外波长检测黄酮苷类成分。

在一些实施方案中，色谱柱优选的柱温为35℃。

在一些实施方案中，所述洗脱流速优选0.3mL/min。

在一些实施方案中，优选采用280nm的紫外波长检测酚酸类组分。

在一些实施方案中，优选采用360nm的紫外波长检测黄酮苷类组分。

在一些实施方案中，优选采用280nm的紫外波长检测酚酸类组分，同时采用360nm的紫外波长检测黄酮苷类组分。

在一些实施方案中，优选采用外标法计算所述黄酮苷类和酚酸类组分的含量。

在一些实施方案中，优选采用一测多评法计算所述黄酮苷类和酚酸类组分的含量，其中黄酮苷类组分以芦丁为内标，酚酸类组分以隐绿原酸为内标。

在一些实施方案中，进样体积为1μL。

在一些实施方案中，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱。

在一些实施方案中，所述色谱柱规格为1.7μm，2.1×150mm。

本发明所述的2种酚酸类组分分别为原儿茶酸和隐绿原酸；所述的14种黄酮类组分分别为碟豆素、芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、异鼠李素。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时测定银杏叶提取物及其制剂中14种黄酮苷类组分和2种酚酸类组分的含量，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率，适合工业大生产的要求。

(2)本发明的方法耐用性好，容易实现，所用仪器设备及试剂均是常规用品，试验参数也是常规参数，无苛刻条件，成本低，大多数实验室的条件均能满足。

(3)本发明的一测多评法，选取两个廉价、易得、稳定的成分作为内参物完成对其他14种成分的同时测定，解决其他成分对照品不易获得所导致的检测方法难以运用到实际生产的问题。

附图

附图1：混合标准品溶液在280nm吸收波长的色谱图；

附图2：混合标准品溶液在360nm吸收波长的色谱图；

附图3：银杏叶提取物在280nm吸收波长的色谱图；

附图4：银杏叶提取物在360nm吸收波长的色谱图；

附图1至附图4均为：1：原儿茶酸；2：隐绿原酸；3：碟豆素；4：芦丁；5：异槲皮苷；6：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；7：山奈酚-3-O-芸香糖苷；8：紫云英苷；9：大波斯菊苷；10：水仙苷；11：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；12：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；13：槲皮素；14：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；15：山奈酚；16：异鼠李素。

具体实施方案

下述是结合具体实施例进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例：

1、色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm,2.1×150mm)；

流动相B：甲醇/乙腈(1:1)；

流动相A：超纯水(含0.1％甲酸)；

流速：0.3mL/min；

柱温：35℃；

进样体积：1μL；

二极管阵列检测器：采用280nm紫外波长检测酚酸类组分，并同时采用360nm紫外波长检测黄酮苷类组分；

分析时间：35min；

梯度洗脱方法：

2.溶液的配制

(1)对照品储备液的制备

精密称取原儿茶酸、隐绿原酸、碟豆素、芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、异鼠李素对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。

(2)样品制备方法

取银杏叶粉末，精密称取1g，置于10ml容量瓶中，加70％甲醇溶液置刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，重复两次，取上清液作为银杏叶样品储备液置4℃冰箱中保存备用。

(3)测定方法

外标法：精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

一测多评法：精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的替代对照品法以峰面积计算，即得，其中校正因子见表1。

3.方法学考察

(1)标准曲线

将上原儿茶酸、隐绿原酸、碟豆素、芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、异鼠李素对照品配制成浓度分别为40ug/ml、40ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、200ug/ml、40ug/ml、100ug/ml、40ug/ml、100ug/ml、40ug/ml、30ug/ml的混合母液，并以2倍逐级稀释成8个点。将上述混合母液按照上述色谱条件进样1μl，记录峰面积，紫外波长280nm下得谱图图1，紫外波长360nm下的谱图图2。紫外条件下，以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得直线回归方程。分别以信噪比S/N 3:1和10:1作为检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)。其标准曲线及线性范围见表1。从表中可以得知，16个化合物在线性范围内相关系数均大于0.999，表明16个化合物线性关系良好。

(2)相对校正因子的计算

相对校正因子的计算方法有两种：一是将各化合物标准曲线截距校正为零后，斜率之比即为各化合物的校正因子；二是按照定义fa/b＝fa/fb＝(Aa/Ca)/(Ab/Cb)，其中A为化合物的峰面积，C为浓度，求得各个校正因子后计算平均值即得。黄酮苷类化合物以芦丁为内标，酚酸类化合物以隐绿原酸为内标，各化合物均适合第一种计算方法。各化合物的相对校正因子于表1中。

表1标准曲线及线性范围、LODs、LOQs和相对校正因子(RCF)

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

(3)精密度、稳定性、重复性试验

分别制备低、中、高三个浓度的标准品溶液，对供试品溶液进行日内、日间精密度和稳定性的考察。日内精密度为低、中、高三个水平的同一份供试品溶液在一天内连续进样6次，日间精密度为连续3天内连续进样6次。稳定性实验为低、中、高3个浓度的供试品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24h内进样。重复性实验为平行制备6份银杏叶提取物样品溶液，连续进样。分别按外标法和“一测多评”法求得各化合物的回收率，并计算RSD值，重复性实验结果见表1，精密度和稳定性实验结果见表2、表3。结果表明，该方法准确、稳定、重复性高，可以用于银杏叶提取物含量测定。

表2外标法计算精密度、稳定性试验结果

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

表3一标多评法计算精密度、稳定性试验结果

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

(4)加样回收率

取已知含量的银杏叶提取物样品置容量瓶中，分别精密加入银杏叶提取物样品中各个化合物含量的80％、100％、120％，每个浓度平行操作3份，按照“2(2)样品溶液的制备”项下方法进行处理，以(测得量-原有量)/加标量×100％计算回收率，并分别按外标法和“一测多评”法求得各化合物的加样回收率，并计算RSD值，结果见表4和5。结果显示，各化合物的加样回收率均在89.1％-105％之间，RSD值均小于5％。

表4外标法计算加样回收率

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

表5一测多评法计算加样回收率

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

4.样品含量测定

“一测多评”分析方法用来测定银杏叶提取物中两种类型的成分：酚酸类和黄酮类成分。3批银杏叶提取物在“1色谱条件”下依次测定，色谱图如图3和图4所示。将外标法和“一测多评”法结果进行对比，结果列于表6。结果表明，“一测多评”分析方法和“外标法”得出的结果基本一致(RSDs<5％)，说明“一测多评”方法可以用来对舒血宁注射液进行质量控制。

表6 3批银杏叶提取物16个化学成分的含量

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素；E.M代表外标法法计算出的含量，N.M代表“少标多评”法计算出的含量，R.D为相对偏差。

5校正因子验证

为了进一步验证相对校正因子的适用性，将银杏叶提取物按照“2(2)样品溶液的制备”项下方法进行处理，分别在不同波长、不同温度及流速下计算相对矫正因子，并与以上实验所得校正因子进行比较分析。结果如表7所示，在不同温度、流速下，相对校正因子稳定可靠，在不同波长下有所差异，但较稳定。

表7校正因子验证结果

注：A：原儿茶酸；B：隐绿原酸；C：碟豆素；D：芦丁；E：异槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-芸香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：异鼠李素。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。