一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法与流程

本发明涉及一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法。

背景技术：

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由流动相带出，实现混合物中各组分的分离并依次进入检测器，检测由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

反相高效液相色谱法：流动相的极性大于固定相的极性，即以非极性键合相为固定相(常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作为固定相)；水或缓冲液，加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂为流动相用以分离检测相关物质的高效液相色谱法。

在生物医药及蛋白质检测分析领域，反相高效液相色谱法被广泛应用于目标物质的分析及定量检测。重组人溶菌酶这种蛋白质具有其特殊的理化性质，发明人发现用反相高效液相色谱法分析检测时存在以下问题：(1)重组人溶菌酶分子量为14000Da，分子量相对较大，用常用的反相C18柱分析经常出现蛋白与填料结合过强而导致无法洗脱，无法正常分析并且损毁色谱柱；(2)重组人溶菌酶为盐溶性蛋白，在100mM以上的氯化钠水溶液中溶解性良好，低于100mM的氯化钠水溶液中重组人溶菌酶溶液会呈现悬浊状态；常用的反相高效液相色谱的流动相中不使用高浓度的氯化钠，这将导致分析过程中重组人溶菌酶处于不完全溶解状态，即使有色谱峰也无法准确反映其量效关系，并且不完全溶解的蛋白也会损坏色谱系统。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种重复性和定量分析的准确度高的重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法。

解决上述技术问题采用的技术方案由下述步骤组成：

1、将重组人溶菌酶标准品溶解于质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液中，配制成重组人溶菌酶标准品溶液，采用反相高效液相色谱对标准品溶液进行分析，色谱分析条件：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50nm、粒径2～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是氯化钠质量浓度为0.9％、三氟乙酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相B是乙腈与超纯水体积比为6:4的混合液且混合液中含有质量浓度为0.9％的氯化钠和体积浓度为0.1％的三氟乙酸，进行梯度洗脱，流动相梯度A:B由(90～0):(10～100)到(50～0):(50～100)，检测波长为280nm，流速为1mL/分钟；绘制色谱主峰面积随重组人溶菌酶浓度变化的标准曲线。

2、将待测重组人溶菌酶样品溶解于质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液中，用滤膜过滤，收集滤液，采用反相高效液相色谱对滤液进行分析，色谱分析条件与步骤1相同。

3、根据步骤2得到的色谱主峰面积，结合步骤1确定的标准曲线的线性方程即可得到待测重组人溶菌酶样品中重组人溶菌酶的浓度。

上述步骤1中，所述的流动相梯度优选0到30分钟A:B由55:45到5:95。

上述步骤1中，所述的填料优选孔径30nm、粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用孔径20～50nm、粒径2～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填料，既可以让重组人溶菌酶这种大分子蛋白在柱上有一定的保留时间，又不会让该蛋白与填料结合过强而导致无法洗脱。

2、本发明通过在流动相中添加氯化钠，从而保证在反相高效液相色谱分析过程中重组人溶菌酶的溶解性，使其能够与流动相完全混溶，保证了色谱峰的踏板数、对称性、重复性、定量分析的准确度。

3、本发明在配制流动相B时先将氯化钠完全溶于超纯水中，然后与乙腈混溶，以避免氯化钠在乙腈中不溶，所采用的配比保证了流动相B良好的溶解性及在整体分析过程中A、B流动相之间良好的混溶性。

4、本发明方法的重复性良好，准确度高，检出限低，重复性、系统适用性、填料的孔径粒径选择，流动相的配方均符合《中华人民共和国药典》2015年版三部附录III B高效液相色谱法要求，可用于重组人溶菌酶的分析与定量检测。

附图说明

图1是线性与范围试验中重组人溶菌酶浓度与色谱主峰面积的关系曲线。

图2是准确度试验中重组人溶菌酶浓度与色谱主峰面积的关系曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、精确称量重组人溶菌酶标准品2896.0mg，其中含重组人溶菌酶150.0mg，加入质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水定容至50.0mL容量瓶中，配制成重组人溶菌酶浓度为3.0mg/mL的标准品溶液；然后用5.0mL容量瓶、质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液精密稀释8个样品浓度，分别为：0.30mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80mg/mL、2.10mg/mL、2.40mg/mL，采用反相高效液相色谱对稀释后的标准品溶液进行分析，色谱分析条件：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径30nm、粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是氯化钠质量浓度为0.9％、三氟乙酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相B是乙腈与超纯水体积比为6:4的混合液且混合液中含有质量浓度为0.9％的氯化钠和体积浓度为0.1％的三氟乙酸，进行梯度洗脱，流动相梯度选择0到30分钟A:B由55:45到5:95，检测波长为280nm，流速为1mL/分钟，上样量为20μL；根据检测结果依次计算塔板数、拖尾因子、色谱峰主峰面积，结果见表1。

表1重组人溶菌酶线性与范围色谱检测统计结果

根据表1的计算结果绘制色谱主峰面积随重组人溶菌酶浓度变化的标准曲线，结果见图1。标准曲线的线性方程为：y＝2435x+29044，式中x代表重组人溶菌酶浓度，y代表色谱主峰面积，R²＝0.99964，线性良好，且踏板数、对称性均符合《中华人民共和国药典》2015年版三部附录III B高效液相色谱法的要求。

精确称量重组人溶菌酶标准品96.53mg，其中含重组人溶菌酶5.0mg，加入质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液定容至5.0mL容量瓶中，配制成重组人溶菌酶浓度为1.0mg/mL的标准品溶液；用5.0mL容量瓶、质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液精密稀释至浓度分别为：1.0×10^-3mg/mL、1.0×10^-4mg/mL、1.0×10^-5mg/mL、1.0×10^-6mg/mL，采用反相高效液相色谱对稀释后的标准品溶液进行分析，色谱分析条件与上述相同，检测结果见表2。

表2重组人溶菌酶检测限与定量限色谱检测统计结果

由表2可见，重组人溶菌酶浓度为1.0×10^-5mg/mL时，主峰保留时间为14.86min，高度为0.43mV，基线噪音高度约为0.04mV，信噪比约为11:1，重组人溶菌酶浓度为1.0×10^-6mg/mL时，主峰保留时间为14.86min，高度为0.26mV，基线噪音高度约为0.04mV，信噪比约为6:1，说明该色谱条件下，重组人溶菌酶上样量为6.0～48.0μg范围内，线性良好，重组人溶菌酶的定量限为1.0×10^-5mg/mL×20μL即0.2ng，检测限为1.0×10^-6mg/mL×20μL即0.02ng。

2、将待测重组人溶菌酶样品溶解于质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液中，用滤膜过滤，收集滤液，采用反相高效液相色谱对滤液进行分析，色谱分析条件与步骤1相同。

3、根据步骤2得到的色谱主峰面积，结合步骤1确定的标准曲线的线性方程即可得到待测重组人溶菌酶样品中重组人溶菌酶的浓度。

为了证明本发明分析方法的重复性和准确性，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：

1、重复性试验

精密配制重组人溶菌酶浓度为1.5mg/mL的标准品溶液，连续进样8次，每次上样量20μL，按照实施例1步骤1的色谱条件进行分析，根据相应主峰面积数值，计算标准偏差(SD值STDEV)、算术平均值(Xbar AVERAGE)，相对标准偏差(RSD)＝标准偏差(SD)/算术平均值(Xbar)×100％，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于1.0％。

表3重组人溶菌酶重复性试验结果

表4重组人溶菌酶重复性试验结果统计分析

由表4的结果可见，连续8次进样，其主峰面积的相对标准偏差为0.52715％，小于1.0％，说明本发明分析方法的重复性良好。

2、准确度试验

精确称量2559.7mg供试品(经含量标定的重组人溶菌酶样品(20151125批)，其中重组人溶菌酶的质量含量为5.86％)，其中含重组人溶菌酶150.0mg，质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液定容至50.0mL容量瓶中，配制成重组人溶菌酶浓度为3.0mg/mL的标准品溶液；用5.0mL容量瓶、质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液稀释5个样品浓度，分别为：0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80mg/mL、2.10mg/mL，按照实施例1步骤1的色谱条件进行分析，结果见表5。

表5重组人溶菌酶标准曲线色谱检测统计结果

根据表5的检测结果，绘制色谱主峰面积随重组人溶菌酶浓度变化的标准曲线，结果见图2。标准曲线的线性方程为：y＝2306.9x+222118.3，式中x代表重组人溶菌酶浓度，y代表色谱主峰面积，R²＝0.99924，线性良好。

精确称量上述供试品170.65mg，其中含重组人溶菌酶10.0mg，加入质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液定容至10.0mL容量瓶中，配制成重组人溶菌酶浓度为1.0mg/mL供试品溶液，用移液管分装成1mL/支(每支含重组人溶菌酶1.0mg，A值)，每支样品中再分别精确称量加入17.15mg供试品(含重组人溶菌酶1.0mg，B值)，共7个样品，按实施例1步骤1的色谱条件进行分析。根据测得的色谱主峰面积和标准曲线y＝2306.9x+222118.3，求得实测浓度，获得实测值C，根据下述公式计算加标回收率：

回收率％＝(C-A)/B×100％

式中A为供试品所含重组人溶菌酶分量；B为加入对照品量；C为实测值。结果见表6。

表6重组人溶菌酶色谱检测法准确性验证统计结果

由表6可见，本发明方法的准确度为95.8％～100.0％，符合中国药典2015版准确度在95％～102％的要求，可用于重组人溶菌酶含量的检测。