药材中齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法与流程

本发明涉及一种齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法，尤其是采用高效液相色谱法测定药材中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，属于化学检测技术领域。

背景技术：

齐墩果酸oleanolicacid和熊果酸ursolicacid都是五环三萜类化合物，是多种中药材均含有的活性成分，其药理作用有保肝、消炎、抗肿瘤、降血脂、增强免疫和抑制免疫(免疫双向调解作用)。其检测的方法有分光光度法、薄层扫描、和高效液相色谱法，齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，仅29、30位的甲基位置不同，分离存在一定困难，要将两者分开，色谱条件的选择非常重要，近年来用hplc测定的方法大多流动相组成复杂，出峰时间长，峰形和分离度不太理想。

快速溶剂萃取(ase)是指在密闭容器内于高温(50～200℃)和高压(500～3000psi)条件下，在短时间内，用有机溶剂提取固体或半固体样品的一种新型样品前处理方法。与超声、微波、回流、超临界萃取等成熟方法相比，ase有萃取溶剂用量少、提取时间短、萃取效率高、操作简单方便、安全和自动化程度高等优点。国外已有学者将这项技术应用于植物药定量和定性分析中样品的前处理，但在中药材有效成分的定量和定性分析中作为样品的前处理方法应用较少据。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种方法简便、快速，且一法多用的药材中齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：

一种药材中齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法，依次包括下述步骤：

1)对照品溶液的制备

分别精密称取齐墩果酸对照品10.84mg至10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为1.084mg.ml^-1对照品储备液；熊果酸对照品20.40mg至25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.7654mg.ml^-1对照品储备液；

2)供试品溶液的制备

精密称取样品粉末0.5g，与1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5ml萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取，萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)将对照品溶液和试品溶液分别注入色谱柱检测，所述的色谱条件：色谱柱为thermoacclaimc30，以体积比85：15乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，流速：0.3ml.min^-1。

进一步的，上述的一种药材中齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法，所述的药材为女贞子或者败酱草或者马鞭草或者枇杷叶或者木瓜或者夏枯草或者山楂或者白花蛇舌草。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：

本发明的提供技术方案立使用快速溶剂萃取法，采用甲醇作为提取溶剂，静态萃取时间6分钟，制备样品溶液，液相色谱分析采用acclaimc30色谱柱，以乙腈-0.2％醋酸(85:15)为流动相，流速为0.3ml.min-1，紫外检测波长为205nm，样品提取时间为10min，待测物齐墩果酸和熊果酸达到基线分离，且无样品基质干扰，线性相关系数大于0.999，平均回收率在95.8％～102.7％之间，本法测定结果与药典标准方法的平均百分含量差异分别3.7％和5.8％。具有方法简便、快速，且一法多用，可用于8种中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。

附图说明

图1是混合对照品hplc色谱图；

图2是各样品hplc色谱图；

图3c18固定相分离齐墩果酸和熊果酸色谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何对本发明做有限次修改可得的技术方案仍然属于本发明所要保护的范围。

实施例1

1仪器与材料

1.1仪器

thermofisherscitificultimate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)、ase350快速溶剂萃取仪(赛默飞世尔科技公司)、xa205du电子分析天平(梅特勒仪器有限公司)，超纯水机(默克密理博公司)。分析柱thermoacclaimc30(3μm，2.1mm×150mm)购自赛默飞世尔科技公司。

1.2试药

对照品齐墩果酸(批号：110709-201206，含量以100％计)，熊果酸(批号：110742-201421,含量以93.8％计)，均由中国生物制品检定研究院提供；实验所用药材均购于玉林药材市场，经广西梧州食品药品检验所黄蘅副主任中药师鉴定；甲醇、乙腈，色谱纯，默克公司；超纯水自制；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果：

2.1色谱条件

色谱柱为thermoacclaimc30(3μm，2.1mm×150mm)，以乙腈-0.2％醋酸(85：15)溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，流速：0.3ml.min^-1，按照上述色谱条件，齐墩果酸和熊果酸的分离度为2.2。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取齐墩果酸对照品10.84mg至10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为1.084mg.ml^-1对照品储备液；熊果酸对照品20.40mg至25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.7654mg.ml^-1对照品储备液。

2.3供试品溶液的制备

精密称取样品粉末(过三号筛)0.5g，与约1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5ml萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取。萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察

分别精密吸取上述2个对照品储备液各0.2、0.5、0.8、1、1.2ml，置5个10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得一系列混合对照品溶液，按照上述确定的色谱条件进样分析。以浓度(μg.ml^-1)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及相关系数，齐墩果酸y＝4783.9428x+97.7319，r²＝0.9999；熊果酸y＝7806.0774x+1.1709，r²＝0.9997,齐墩果酸在21.68～130.08μg.ml^-1、熊果酸在15.31～91.85μg.ml^-1范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度试验

取其中一个混合对照品溶液(齐墩果酸浓度为108.4μg.ml^-1,熊果酸浓度为76.54μg.ml^-1)，连续进样6次，记录峰面积，结果峰面积rsd分别为1.2％、1.6％，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

取马鞭草(批号15062801)、枇杷叶(批号20160401)、木瓜(批号151202)3个品种供试品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、3、6、12h测定，记录峰面积。结果马鞭草、枇杷叶、木瓜中齐墩果酸峰面积的rsd分别为2.1％、1.8％、2.9％，熊果酸峰面积的rsd分别为2.5％、2.3％、1.5％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.7重复性试验

取马鞭草(批号15062801)、枇杷叶(批号20160401)、木瓜(批号151202)3个品种供试品各6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，测得马鞭草、枇杷叶、木瓜中齐墩果酸含量的rsd分别为2.4％、2.7％、2.2％；熊果酸含量的rsd分别为1.8％、2.0％、1.6％，试验表明方法重复性良好。

2.8加标回收率试验

取已测定含量的马鞭草(批号15062801)、木瓜(批号151202)供试品各9份，每份0.25g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸、熊果酸对照品储备液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，齐墩果酸加标回收率为96.0％～100.2％，rsd为0.5％～1.7％；熊果酸回收率为96.1％～102.7％，rsd为0.4％～1.5％，表明该方法的准确度良好。结果详见表1。

表1加样回收率试验结果

2.9含量测定及与药典测定方法结果的比较

取女贞子、夏枯草、白花蛇舌草、败酱草、山楂5种中药材各1批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行含量测定。取马鞭草、枇杷叶、木瓜3种中药材各3批，分别照“2.3”项下方法及《中国药典》2015年版一部品种项下方法制备供试液，按上述色谱条件进行测定，取两种方法得到的含量结果进行t检验，根据t值表，所得t值＜t(df)0.05＝1.86，即两种方法差异不显著。结果详见表2和表3；以及图1和图2，其中：1-齐墩果酸，2-熊果酸；a.女贞子b.败酱草c.马鞭草d.枇杷叶e.木瓜f.夏枯草g.山楂h.白花蛇舌草，

表25种中药材中齐墩果酸及熊果酸含量。

表3快速溶剂萃取方法与药典方法结果对比

3讨论

3.1ase提取条件的选择

根据检测成分溶解度并参照文献^[5、7]选择甲醇、70％乙醇和无水乙醇进行提取溶剂选择，结果显示甲醇、70％乙醇和无水乙醇提取时，齐墩果酸和熊果酸的萃取率基本一致，且色谱图中杂峰也并无明显差别，考虑到与提取介质的兼容性以及便捷性，采用甲醇作为提取溶剂，并确定甲醇在萃取温度为100℃、萃取时间为6min时提取效果较为理想。

确定甲醇作为提取溶剂后，考察萃取循环次数对齐墩果酸和熊果酸含量的影响，取样品分别进行萃取1次、2次、3次循环次数考察，结果表明萃取次数对结果无影响，故确定萃取循环次数为1次即可。

3.2色谱分析条件优化

熊果酸和齐墩果酸结构及理化性质极为相近，实验曾使用syncronisc18，zorbaxextend-c18，kinetexxb-c18，excel2c18等十八烷基键合相进行分离，结果齐墩果酸和熊果酸均未能达到基线分离，图谱详见图3。c30色谱柱键合的碳链更长，对分子构型的选择性更强，适于异构体的分离，使用acclaimc30色谱柱后两者能实现分离，且出峰时间与分离度均达到满意效果，故确定使用acclaimc30色谱柱进行分析。为确保目标成分处于游离分子态，流动相中需要加入少量酸，分别考察加入0.1％醋酸、0.2％醋酸及0.5％醋酸对洗脱强度的影响，结果表明0.2％醋酸已能满足实验分离需要。考察不同柱温对色谱行为的影响发现，降低柱温对分离有利，最终确定18℃为最佳分离温度。

3.3快速溶剂萃取法与药典方法效率对比

根据《中国药典》2015年版马鞭草、枇杷叶、木瓜3种药材提取时间分别约为300min、30min、20min，而使用本试验方法提取时间仅需10min，提取效率大为提高。药典方法使用c18色谱柱，分析时间约为35min至65min，本试验分析时间仅为8min，分析效率提高了至少4倍。另外使用0.2％醋酸作为流动相相比药典方法使用缓冲盐或三乙胺，配制过程更简便。

齐墩果酸和熊果酸具有保肝、消炎、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性，在很多中药材中普遍存在。本申请所述8种中药材，目前或无此项检测规定，或目标峰分离效果差，或样品制备方法耗时费力。因此建立统一的分析检测方法对于完善中药材质量评价，减少检测成本具有重要意义。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。