一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测方法与流程

本发明涉及一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测技术，特别是一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测方法。

背景技术：

内分泌干扰物(endocrinedisruptingchemicals，edcs)是一类可以干扰生物体或人类内分泌系统的外源性化学物质。已有的研究已发现内分泌干扰物普遍存在环境介质中，包括水、土壤和空气等各个环境介质中。内分泌干扰物会通过食物链网迁移到各个角落并沿着食物链呈现放大作用，对人类和动物构成巨大威胁。在人和动物的体液，包括血液、尿液、脐带血，甚至新生儿的体液中都广泛检测出内分泌干扰物的污染，如双酚a(bpa)、壬基酚(np)、辛基酚(4-t-op)和叔丁基酚(4-t-bp)等。加之，毒理学实验及流行病学调查结果表明，环境中大量存在的edcs可能危害人类和生物体的内分泌、生殖、神经和免疫系统等的正常功能，并很可能导致生长发育异常、内分泌紊乱、婴幼儿畸形等，严重影响人类的生存与发展。因此，内分泌干扰物的问题引起了世界许多国家政府、相关学者和有关国际组织的高度重视，被视为继臭氧层破坏、温室效应之后的又一个全球性的环境问题。

因此，检测生物体中内分泌干扰物的浓度，是明确内分泌干扰物对生物体污染的前提。但是，很多生物样品，例如动物的器官，胆汁，血液等，含有很多复杂的生物基质，很难水解完全。加之，大部分edcs比传统污染物极性更强，并且在生物中的低浓度，使得检测分析方法更加困难和复杂，无法实现对生物体中edcs的定量分析，尤其是多组分同时分析遭遇巨大挑战。

针对复杂的生物基质，目前关于内分泌干扰物的高效快速检测方法还鲜有报道。因此，亟需提出一种容易操作，能够有效检测复杂生物基质中内分泌干扰物的浓度，实现对生物体中内分泌干扰物定量分析的快速检测方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测方法，该检测方法采用加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化、固相萃取以及液相色谱-质谱分析相结合的技术，能够有效检测复杂生物基质中内分泌干扰物的浓度，实现对生物体中内分泌干扰物的定量分析，该检测方法容易操作，具有有机溶剂用量少、对待测物的选择性高、萃取速度快、样品回收率高等优点，适用于分析含量低且结构复杂的生物体中内分泌干扰物。

本发明是这样实现的：

一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测方法，包括下述步骤：

s1：加速溶剂萃取并复溶：

s11：加速溶剂萃取：称取待测样品，将待测样品置于冷冻干燥机中进行干燥；然后进行研磨，研磨后置于加速溶剂萃取仪萃取池中，并加入同位素内标混合物，在设定好的温度条件下，采用萃取溶剂提取待测样品，收集得到溶解有内分泌干扰物的萃取液；

s12：复溶：蒸发掉步骤s11获得的萃取液中的萃取溶剂，采用复溶溶剂ⅰ溶解内分泌干扰物，得到溶解液ⅰ；

s2：自动凝胶渗透色谱净化并复溶：

s21：自动凝胶渗透色谱净化：将溶解液ⅰ进行自动凝胶渗透色谱净化分析，收集流出组分液；

s22：复溶：蒸发掉s21获得的流出组分液中的溶剂，采用复溶溶剂ⅱ溶解内分泌干扰物，得到溶解液ⅱ；

s3：固相萃取并复溶：

s31：活化：活化固相萃取小柱，然后将溶解液ⅱ通过固相萃取小柱；

s32：收集洗脱液：真空干燥固相萃取小柱，然后洗脱留在固相萃取小柱上的样品，用氮吹管接收，收集到洗脱液；

s33：将氮吹管置于氮吹仪上氮吹浓缩后，采用复溶溶剂ⅲ溶解内分泌干扰物，得到溶解液ⅲ；

s4：采用液相色谱-质谱联用仪分析溶解液ⅲ，完成内分泌干扰物的定量检测。

优选地，所述步骤s11中的萃取溶剂为正己烷和丙酮，所述正己烷和丙酮的用量体积比为1：1。

优选地，所述步骤s12中复溶溶剂ⅰ为乙酸乙酯和环己烷，所述乙酸乙酯和环己烷的用量体积比为1：1。

优选地，所述步骤s22中溶溶剂ⅱ为正己烷。

优选地，所述步骤s2中，自动凝胶渗透色谱净化的参数条件为如下：

填料为50g200-400目中性多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体(bio-beads-x3)，柱规格40cm×2cmi.d，紫外检测器检测波长240nm，流动相为体积比为1:1的乙酸乙酯/环己烷，流速5ml/min，进样量5ml，收集20～30min的流出组分液。

优选地，所述步骤s31中固相萃取小柱活化方法为：使用5ml甲醇、5ml丙酮和5ml的乙酸乙酯依次通过固相萃取小柱，随后用5ml体积分数0.1％的醋酸溶液通过固相萃取小柱。

优选地，所述步骤s32中真空干燥时间为10min，

所述步骤s33中氮吹浓缩后加入甲醇并定容至100μl。

优选地，所述步骤s4中的检测条件如下：

agilentec-c18柱：3.0mm×100mm，2.7μm；

采用dmrm模式检测；

离子喷射电压为-4500v；

干燥气温度为350℃；

干燥气流速为10l/min；

进样体积为5μl；

流动相为0.4ml/min体积比40％甲醇和60％水的混合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明加标回收率在81.2％-98.3％之间，相对标准偏差为2.13％-4.89％；

(2)凝胶渗透色谱结合固相萃取技术具有萃取速度快、待测物的选择性高、对样品回收率高等优点，更适合可靠的分析浓度含量低，种类繁多的edcs样品；

(3)相较于传统的化学试剂水解生物样品，本方法水解生物样品更完全，能够处理生物基质更为复杂的生物样品，同时具有有机溶剂用量少、等特点，更加适用于结构、成分复杂的生物样品。

附图说明

图1是鱼类肝脏样品中5种edcs的回收率。

图2是5种edcs的lc/ms/ms分析谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

本发明提供一种复杂生物基质中内分泌干扰物的检测方法，该方法是基于加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化、固相萃取技术以及液相色谱-质谱法相结合测定复杂生物基质中的内分泌干扰物。

下面以鱼体肝脏中5种内分泌干扰物的检测为例，检测方法和检测步骤如下：

s1：加速溶剂萃取并复溶

s11：加速溶剂萃取：选择健康的鱼体样品取5g(脂肪含量约为1g时，称取样品量为2-10g)的肝脏于样品瓶中，经冷冻干燥机干燥后，研磨后置于加速溶剂萃取仪萃取池中，用硅藻土填充，加入100μl200μg/l的同位素内标混合物(¹³c-bpa和¹³c-n-np)。用体积比为1:1的正己烷和丙酮作为萃取溶剂，在萃取温度80℃下进行萃取；

s12：复溶：蒸发掉步骤s11获得的萃取液中的萃取溶剂，加入体积比1:1为的乙酸乙酯和环己烷的复溶溶剂ⅰ溶解内分泌干扰物，并复溶至6ml，得到溶解液ⅰ；

s2：自动凝胶渗透色谱净化并复溶：

s21：自动凝胶色谱净化：将溶解液ⅰ经自动凝胶渗透色谱净化，自动凝胶渗透色谱净化的参数条件为如下：填料为50g200-400目中性多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体(bio-beads-x3)，柱规格40cm×2cmi.d，紫外检测器检测波长240nm；流动相为乙酸乙酯/环己烷(1:1，v/v)，流速5ml/min，进样量5ml，收集20～30min流出组分并减压蒸发至近干，

s22：复溶：蒸发掉步骤s21获得的流出组分液中的溶剂，加2ml正己烷(复溶溶剂ⅱ)溶解内分泌干扰物，得到溶解液ⅱ；

s3：固相萃取并复溶：

s31：活化：oasishlb固相萃取小柱，使用5ml甲醇、5ml丙酮和5ml的乙酸乙酯依次通过固相萃取小柱，随后用5ml体积分数0.1％的醋酸溶液活化后(注意在更换溶剂的时候不可使固相萃取小柱干燥，务必保持湿润的状态)，然后将溶解液ⅱ逐滴缓慢地通过固相萃取小柱；

s32：收集洗脱液：在真空条件下使固相萃取小柱干燥10min后，利用10ml体积比为1:1的丙酮和乙酸乙酯洗脱留在固相萃取小柱上的样品，用氮吹管接收，收集到洗脱液；

s33：将氮吹管置于氮吹仪上经氮吹浓缩后，加入甲醇(复溶溶剂ⅲ)溶解内分泌干扰物并定容至100μl；

s4：采用液相色谱-质谱联用仪分析溶解液ⅲ，完成内分泌干扰物的定量检测，其色谱柱检测条件为：

agilentec-c18柱：3.0mm×100mm，2.7μm；

采用dmrm模式检测，有正离子和负离子方式检测；

离子喷射电压为-4500v；

干燥气温度为350℃；

干燥气流速为10l/min；

进样体积为5μl；

流动相为0.4ml/min体积比40％甲醇和60％水的混合物为流动相。

五种物质的扫描特征离子如表1所示：

表1五种物质的特征离子、保留时间和检测模式

数据分析：在空白实验中(甲醇)中分别添加低、中、高3个水平的5种edcs的混合标准溶液，每个水平做3份，按试验方法进行平行测定。

如图1所示，为鱼类肝脏样品中5种edcs的回收率；图2为5种edcs的lc/ms/ms分析谱图，为标准谱图，通过保留时间(t)来定性确定5种edcs，通过丰度(abundance)确定各类待测物的响应值，并采用与标准曲线相对比的方法来定量。

图1和图2的检测结果显示，5种edcs的回收率在81.2％-98.3％之间，相对标准偏差为2.13％-4.89％。在鱼肝脏样品中添加2种¹³c试剂(¹³c-bpa和¹³c-n-np)作回收率指示剂，实验测得¹³c试剂的回收率分别为82.5±8.01％和80.3±9.55％，满足实验要求。实验结果测得鱼体肝脏中5种edcs的浓度范围为0.63-138μg/l，表明目标化合物的检测具有良好的重现性。较于化学试剂水解生物样品和传统的萃取技术，本方法具有有机溶剂用量少、水解生物样品更完全等特点，萃取速度快、待测物的选择性高、对样品回收率高等优点，更加适用于结构、成分复杂的生物样品，类似于肝脏这类生物样品中痕量edcs的检测分析。

本实验方法中，edcs的测定下限为四倍的检出限浓度。本实验方法还用于检测鱼体胆汁中5种内分泌干扰物的浓度水平，每个样品取20μl的胆汁于离心管中，经上述实验方法进行前处理和仪器分析检测，结果显示，5种edcs的回收率在78.9％-113.7％之间，相对标准偏差为5.13％-7.89％。在胆汁样品中添加的2种¹³c试剂(¹³c-bpa和¹³c-n-np)回收率分别为87.9±5.35％和95.3±6.31％，满足实验要求。

因此，根据我们的研究结果表明，采用加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化、固相萃取以及液相色谱-质谱分析相结合的技术，能够有效消解多种复杂生物基质，特异、高效地检出内分泌干扰物。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。