纳米复合材料、SDM电化学适体传感器的制备方法及检测方法与流程

本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种纳米复合材料、sdm电化学适体传感器的制备方法及检测方法。

背景技术：

磺胺二甲氧嘧啶(sdm)是一种磺酰胺类药物，可有效作用于大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，为广谱抗菌药，是畜禽生产中用于抗细菌及原虫感染的常用磺胺药之一。但sdm的不合理使用导致药物在动物粪便或组织中残留；一方面，含残留药物的粪便作为肥料用于农业耕作进而污染土壤，并影响土壤中微生物的生长；另一方面，人们长期食用含残留药物的动物源性食品也会危害其身体健康。为了保护环境以及消费者的健康，许多国家的政府，如欧盟委员会以及中国都采用100ng/ml作为动物源性食品中sdm的最大残留限量。

传统的用于sdm分析检测的方法有高效液相色谱法(hplc)，气相色谱-质谱联用分析法(gc-ms)和毛细管电泳法(ce)等。但这些方法对于实验条件和技术人员的要求较高，操作繁琐耗时，仪器设备昂贵、检测成本高等；另外，其检测结果的特异性和灵敏度往往较低，通常无法满足微量sdm检测的实际需求。因此，开发一种简便、敏感特异的sdm检测新技术和新方法具有非常重要的意义。

适体(aptamer)，是利用指数富集的配体系统进化(selex)技术，从人工构建的随机核酸库中筛选获得的与目标配体具有高效专一结合的单链dna或rna片段。与抗体相比，适体具有稳定性好、成本低、目标物作用范围广、高特异性和亲合力等优点。将适体作为识别元件与电化学传感技术相结合构建的电化学适体传感器，既具有电化学分析的高灵敏度、快响应、低成本，又具有适体的高选择性和强特异性等优点，在疾病诊断、环境监测和药物分析等方面具有广阔的应用前景。为进一步提高电化学适体传感器的检测灵敏度以达到实际应用的需求，近年来，新型的信号放大技术在电化学适体传感器的构建中得到了广泛的应用。其中，纳米材料因其独特的理化性质(量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等)和较好的生物相容性，在提高传感器的灵敏度方面，具有很好的应用前景。

新型复合纳米材料的设计制备方面，石墨烯掺杂c60(rgo-c60)纳米复合物在维持石墨烯原有优点的基础上，进一步增加其活性比表面积和导电性；聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)作为一种强阳离子电解质和高分子抗静电剂，可以防止rgo-c60自身的团聚，使制备的纳米复合物获得良好的分散性，提高传感器响应的稳定性。因此，该新型的p-rgo-c60复合材料不仅具有较大的比表面积和良好的导电性，还可以显著提高生物分子的活性，增加电活性物质的固载量。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明一方面提供了一种p-rgo-c60纳米复合材料，由如下步骤制备得到：1)制备c60水溶液；2)将氧化石墨烯超声分散在超纯水中，加入步骤1)制得的c60水溶液，然后滴加pdda，搅拌，滴加水合肼，80～110℃反应3～5h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到p-rgo-c60纳米复合材料溶液。

在上述技术方案中，所述步骤1)中c60水溶液的制备方法为：将甲苯加入到c60粉末中，然后用超声处理得到深紫色溶液，然后加入超纯水，静置分层，连续超声处理10～12h，直到甲苯相的c60转移到水相中，待甲苯完全蒸发，最终得到棕黄色溶液，最后用0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，得到纯c60水溶液。

本发明另一方面提供了一种p-rgo-c60-pt@au纳米复合材料，由如下步骤制备得到：

1)制备纳米金溶胶；

2)制备pt@au核-壳微球颗粒：将步骤1)制备的纳米金溶胶加入超纯水中，加热至70～90℃，加入h2ptcl6溶液，然后滴加抗坏血酸，将混合溶液加热回流直到溶液颜色不变，冷却至室温，得到pt@au核-壳微球溶液；

3)p-rgo-c60-pt@au：将步骤2)制得的pt@au核-壳微球溶液加入权利要求1所述的p-rgo-c60溶液中，然后在3～5℃下反应12～16h，离心、洗涤、定容，即得到p-rgo-c60-pt@au纳米复合材料；

在上述技术方案中，所述步骤1)制备纳米金溶胶的方法为：将1ml1％haucl4溶液加入100ml超纯水中，加热沸腾后快速加入2.5ml1％柠檬酸三钠溶液，颜色将从蓝色变为红色，继续加热15min，冷却后用超纯水重新定容，得到透明酒红色溶液纳米金溶胶。

本发明另一方面提供了一种用于sdm检测的电化学dna适体传感器，由以下方法制备得到，该方法包括以下步骤：

1)用tcep溶液室温下处理巯基标记的sdm结合适体，时间0.5～1.5h，储存备用；

2)分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末将玻碳电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；

3)将步骤2)得到的电极进行电化学清洗，然后用超纯水冲洗，干燥；

4)将6～10μl前述的p-rgo-c60溶液滴加到步骤3)清洁的玻碳电极表面上，室温干燥，然后在3～5℃下将god溶液滴加到电极上，存放8～12h备用；

5)将3μl前述的p-rgo-c60-pt@au溶液滴加到步骤4)得到的电极表面上；室温干燥；

6)步骤1)制得的sdm结合适体，滴加在步骤5)制备得到的电极上室温孵育12～16h；

7)将步骤6)得到的电极浸入god溶液中0.5～1.5h，即得到用于sdm检测的电化学dna适体传感器。

本发明另一方面提供了一种利用电化学dna适体传感器检测sdm的方法，包括如下步骤：

1)向上述的适体传感器的电极上滴加不同浓度的目标物磺胺二甲氧嘧啶；

2)将电极置于0.1mpbs溶液中进行表征，测量其电流变化值；

3)根据步骤2)所得电流变化值与sdm浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

4)将待测样品用权利要求5所述的适体传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的sdm浓度。

本发明首先制备化学性能优异的聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化石墨烯掺杂c60(p-rgo-c60)复合纳米材料作为传感器的敏感界面，利用石墨烯和c60较大的比表面积和多孔特征在提高葡萄糖氧化酶(god)固载量的同时促进god与电极之间的电子传递；然后将铂金纳米粒子修饰的p-rgo-c60复合材料用于固载巯基标记的单链sdm适体，同时能进一步增强god的电化学信号并保持god和sdm适体良好的生物活性；最后通过适体与不同浓度目标物的特异性结合引起电化学信号的不同变化，来实现对sdm的定量检测。所制备的电化学适体传感器成功用于sdm的超灵敏检测。与传统的sdm检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，方便，成本低，无污染，从而为磺胺二甲氧嘧啶的检测提供了新的分析方法。

本发明的有益效果是：

1)利用石墨烯和c60较大的比表面积和多孔特征在提高葡萄糖氧化酶(god)固载量的同时促进god与电极之间的电子传递，因而能有效增强电化学响应信号、提高传感器的检测灵敏度。

2)铂金纳米粒子修饰p-rgo-c60复合材料：用于固载巯基标记的单链sdm适体，同时能进一步增强god的电化学信号并保持god和sdm良好的生物活性；

3)适体用于目标物的识别具有高度的特异性，可提高传感器的选择性，从而为微量sdm的检测提供了新的研究方向和分析方法。

4)涉及的材料均可在实验室条件下合成，操作简单，原材料便宜且易得，每次使用量极少，大大的节约了成本。

5)本方法制备的电化学适体传感器可为磺胺二甲氧嘧啶的检测提供新方法，进而拓展药物检测分析方法的应用；该发明所制备的电化学适体传感器也可应用于临床疾病诊断、生物样本测定、药物的分析检测和环境的监测等方面。

6)整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度相比以往的报道有所提高2～3个数量级，可以达到fg/ml。

说明书附图

图1是本发明电化学适体传感器构建和检测原理示意图。

图2是不同修饰电极在0.1mpbs(ph7.0)中以100mv/s的扫描速率得到的循环伏安表征图。

图3是不同浓度的sdm通过本发明传感器检测的结果，其中，图a为在0.1mpbs(ph7.0)中传感器对不同浓度sdm扫描的循环伏安图，a→i：0,0.00001,0.0001,0.001,0.01,0.1,1，10和50ng/ml；图b为传感器电流响应值与不同浓度sdm对数值的校准曲线。

图4是0.01ng/mlsdm孵育的传感器在连续扫描80圈循环伏安曲线后得到的稳定性检测图。

图5是sdm适体传感器的特异性检测图，其中，blank为空白，sdm浓度为10ng/ml，mixture为混合物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：

氯金酸(haucl4)，聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)，氯铂酸(h2ptcl6)和水合肼(hydrazinehydrate)购自sigma(usa，www.sigmaaldrich.com)。氧化石墨烯(rgo)和c60粉末购自南京先丰纳米有限公司(南京，中国，www.xfnano.com)。葡萄糖氧化酶(god)，抗坏血酸(aa)，金霉素(ctc)，链霉素(stc)，替考拉宁(tcl)，四环素(tcc)和磺胺二甲氧嘧啶(sdm)购自j&kscientificltd.(beijing，jkchemical.com)。

sdm结合适体(sba)的dna寡核苷酸序列为：5’-sh-c6-gagggcaacgagtgtttataga-3’，由上海生工有限公司合成。

所用设备及技术参数：

仪器：用chi660e电化学工作站(中国上海辰华仪器)进行循环伏安法(cv)测定。电化学检测采用三电极系统：修饰后的玻碳电极(直径4mm)作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极(sce)作为参比电极。ph计监测ph值(mp230，mettler-toledo，瑞士)。三电极系统在ph7.0pbs中以100mv/s的扫描速率从0.25～0.65v的循环伏安法(cv)。通过场发射扫描电子显微镜(fesem，jsm7800f，japan)表征材料的形态。从nicolet6700ftir光谱仪(thermonicole，usa)获得傅里叶变换红外(ftir)光谱。

实施例1制备p-rgo-c60-pt@au纳米复合材料

按照如下步骤操作：

(1)p-rgo-c60纳米复合材料的制备：

1)将5ml甲苯加入到5mgc60粉末中，然后用超声处理得到深紫色溶液，然后加入5ml超纯水，静置分层，然后连续超声处理10～12h，直到甲苯相的c60转移到水相中，待甲苯完全蒸发，最终得到棕黄色溶液，最后用0.45μm过滤器过滤，得到纯c60水溶液。

2)将5mg的氧化石墨烯(rgo)超声分散在5ml超纯水中，加入5ml步骤1)制备的c60水溶液，然后滴加40μl的pdda(20％)。搅拌30min后，滴加100μl水合肼(80％)90℃下反应4h；最后在10000r/min离心5min洗涤过量的pdda和水合肼，再将沉淀物分散在10ml超纯水中，即得到p-rgo-c60纳米复合材料溶液。

(2)p-rgo-c60-pt@au纳米复合材料的制备：

1)通过柠檬酸钠还原得到纳米金溶胶(aunps)，制备方法如下：将1ml1％haucl4溶液加入100ml超纯水中，加热沸腾后快速加入2.5ml1％柠檬酸三钠溶液，颜色将从蓝色变为红色，继续加热15min。冷却后用超纯水重新定容至原100ml，得到透明酒红色溶液纳米金溶胶(13nm)。

2)pt@au核-壳微球颗粒(pt@aunps)：将上述制备的纳米金溶胶20ml加入30ml超纯水中，加热至80℃，快速加入2.5ml1％h2ptcl6溶液，然后滴加1.75ml1％抗坏血酸(aa)，然后溶液迅速变黑。将混合溶液加热回流直到溶液颜色不变，然后冷却至室温，得到pt@au核-壳微球溶胶。最后，重新定容至50ml，并在4℃下转移至棕色瓶中以备使用。

3)p-rgo-c60-pt@au：将20mlpt@au核-壳微球溶胶加入5ml步骤(1)制备得到的p-rgo-c60溶液中，然后在4℃下反应12～16h。最后离心洗涤并重新定容至5ml，即得到p-rgo-c60-pt@au纳米复合材料。

实施例2制备用于sdm检测的电化学dna适体传感器

按照如下步骤操作：(构建原理如图1所示)

1)用10mm的tcep溶液室温下处理巯基标记的sdm结合适体(sba)的dna单链，时间1h，备用。

2)分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末将玻碳电极(gce)抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极各5min，室温干燥备用。

3)将步骤2)得到的电极在0.5mh2so4中进行电化学清洗，电位扫描为0.2～1.6v，直至获得可稳定的循环伏安图，然后再次用超纯水冲洗并在空气中干燥。

4)将8μl实施例1中制备得到的p-rgo-c60溶液滴加到步骤3)清洁的玻碳电极表面上，并在室温下空气干燥；然后，将20μlgod溶液滴加到电极上，盖上盖子4℃下存放8～12h备用。

5)将3μl实施例1中制备得到的p-rgo-c60-pt@au溶液滴到步骤4)得到的电极表面上，用于固载与磺胺二甲氧嘧啶结合的适体(sba)，室温干燥。

6)取20μl步骤1)制得的2μm的sba滴加在步骤5)制备得到的电极上室温孵育12～16h。

7)将步骤6)得到的电极浸入god溶液中1h，以封闭剩余的非特异性结合位点，即得到用于sdm检测的电化学dna适体传感器。所得到的适体传感器和所有材料及试剂在不使用时储存于4℃。

实施例3利用电化学dna适体传感器检测sdm

利用实施例2构建的电化学dna适体传感器检测sdm，按照如下步骤操作：

一、绘制工作曲线

1)将实施例2步骤3)至步骤7)的修饰电极分别置于含0.1mna2hpo4，0.1mkh2po4，10mkcl和2mmmgcl2的0.1mpbs中进行表征，测量其电化学响应信号，结果如图2所示：(a)裸gce；(b)滴加p-rgo-c60；(c)孵育god；(d)滴加p-rgo-c60-pt@au；(e)与sba结合；(f)god封闭。

2)向实施例2制得的适体传感器的电极上滴加20μl不同浓度的目标物磺胺二甲氧嘧啶，分别测定其电流变化情况。

3)根据所得电流变化值与磺胺二甲氧嘧啶浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线(如图3b所示)。测定结果表明电流响应值与磺胺二甲氧嘧啶在10fg/ml－50ng/ml浓度对数值范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9965，检测限为8.68fg/ml；结果如图3所示：其中图3a曲线a→i对应的sdm检测浓度分别为0,0.00001,0.0001,0.001,0.01,0.1,1，10和50ng/ml。

二、传感器的稳定性测试：将实施例2制得的传感器于4℃保存，每间隔5天检测传感器一次，储存20天后电流响应仍为初始电流的90.4％，表明传感器具有良好的稳定性。取上述传感器在最佳条件下连续进行80圈cv测量后，其响应电流仅降低约4.1％，如图4所示。

三、传感器重现性测试：取同一批次制备的传感器5支，在相同条件下对浓度为1ng/ml的磺胺二甲氧嘧啶分别进行测定，每一支电极测定3次，结果响应电流的相对标准偏差少于4.67％；另外，取不同批次制备的传感器3支，在相同条件下对1ng/ml的磺胺二甲氧嘧啶分别进行测定，每一支电极测定3次，结果响应电流的相对标准偏差少于4.58％，说明传感器批内及批间差异小，传感器重现性良好。

四、传感器特异性测试：为了研究提出的适应传感器的特异性，采用几种潜在的干扰药物：金霉素(ctc)，链霉素(stc)，替考拉宁(tcl)和四环素(tcc)，在相同浓度及条件下测定的不同干扰物质在0.1mpbs中电流响应值。结果表明(如图5所示)，提出的基于sdm-sba的高特异性反应的适体传感器具有令人满意的特异性。