本发明涉及食品安全领域，具体地说，涉及雷公藤乙素作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂采集了蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制之后形成的具有甜味食品。蜂蜜属于传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。通常情况下，蜂蜜甘甜可口、无毒无害。我国地大物博，部分区域分布着大量的有毒蜜源植物，如雷公藤、昆明山海棠、乌头、黄杜鹃和钩吻等。蜜蜂采集了这些植物的花蜜之后，便会酿制成有毒蜂蜜，这些蜂蜜一般对蜜蜂毒性较小，但对人的毒性较大，人一旦误食了这些有毒蜂蜜之后，发生蜂蜜中毒，严重者甚至致人死亡。
据不完全统计，2014-2016年，三年期间我国一共爆发了9起蜂蜜中毒事件，涉及的中毒人群高达99人，致人死亡的有13人。可见蜂蜜中毒对我国危害严重，涉及人数之多、致死率之高，已经属于严重的公共卫生事件，受到全社会的关注。蜂蜜中毒并非近期新出现现象，明代《本草纲目》中详细的记载了“七月勿食生蜜，令人暴下霍乱”。古人在生产生活中便已经意识到了夏季所产的蜂蜜可能有毒，特别是干旱的天气里，易于发生中毒事件；并怀疑有毒蜂蜜可能和有毒蜜源植物相关。此外，国外也有“蜂蜜中毒”事件的报道，尤其是是毗邻黑海的土耳其地区和青藏高原的尼泊尔地区，每年都有蜂蜜中毒事件的发生。通过对蜂蜜中毒地区蜜源植物的调查，确定了这些有毒蜂蜜是由蜜蜂采集了有毒的品种杜鹃花的花蜜。科研人员通过对有毒蜂蜜和中毒人员血液的分析，发现木藜芦毒素(grayanotoxin，gtx)i和iii是有毒蜂蜜主要毒性成分，并将木藜芦毒素iii作为杜鹃花有毒蜂蜜的生物标志物。目前，有关我国蜂蜜中毒事件的原因，学者们怀疑是由蜜蜂采集了雷公藤和博落回的花蜜和花粉，其依据是在有毒蜂蜜的样本中发现了大量的博落回花粉和少量的雷公藤花粉。农业部蜂产品监督检验测试分析中心(北京)多年来一直从事有毒蜜源植物的调查和有毒蜂蜜的研究工作，通过多个蜂蜜中毒事发区域的连续调查，初步确定了有毒蜂蜜与蜜蜂采集了雷公藤、昆明山海棠的花蜜高度相关。通过实验室分析，发现了雷公藤花中雷公藤甲素迁移到花蜜，由蜜蜂采集后转移至蜂蜜中。但是本课题组通过采集的80余个疑似有毒蜂蜜样本分析发现了有毒蜂蜜中雷公藤甲素的平均含量仅为500μg/kg。基于雷公藤甲素在小鼠中的半数致死量ld500.92mg/kg，蜂蜜中所含有的雷公藤甲素不足以致人死亡，因此，单纯的以雷公藤甲素作为蜂蜜的标志物不够科学合理。因此，有毒蜂蜜中依然含有未识别出的高毒性物质。目前在雷公藤植物体中已经识别和鉴定出了300余种化合物，可以大致将其归为雷公藤二萜类、三萜类以及生物碱类，其中二萜类化合物的毒性最强，具有显著生理活性；三萜和生物碱类毒性相对较小，分别在医药和杀虫剂方面有所应用。二萜类物质中以雷公藤甲素、乙素、15-羟基雷公藤甲素和16-羟基雷公藤甲素等物质为代谢表，是雷公藤属植物致人中毒的最主要的成分。调查发现，人摄入20-50g的有毒蜂蜜便可致人中毒，严重者甚至死亡。因此，有毒蜂蜜中可能含有大量的雷公藤二萜类物质，除了已报道的雷公藤甲素之外，可能还含有其类似物。基于此，本研究开展有毒蜂蜜生物标志物的研究，旨在选择出最佳的标志物。
阐明有毒蜂蜜的致毒的物质基础，识别和鉴定出其生物标志物具有重要意义。有毒蜂蜜一旦流入市场，将会严重危害蜂蜜消费者的生命健康。基于有毒蜂蜜的生物标志物可以快速开发出其鉴别方法，从而为监控有毒蜂蜜的分布、流通以及蜂蜜中毒事件的快速诊断提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有有毒蜂蜜识别和鉴定方法的不足，识别和鉴定出一种全新的有毒蜂蜜生物标志物，并利用该标志物建立有毒蜂蜜的检测方法，用于有毒蜂蜜的鉴定和蜂蜜中毒人群的诊断。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
本发明的技术方案之一是：雷公藤乙素作为生物标志物在有毒蜂蜜的识别和鉴定方面的应用。
所述雷公藤乙素的化学结构式如图3所示。
本发明的技术方案之二是：建立了一种基于液相串联高分辨质谱技术检测蜂蜜样本中雷公藤乙素的方法。该方法采用uhplc-qexactivepuls检测蜂蜜样本，通过查看其图谱中是否含有雷公藤乙素的特征峰，判定蜂蜜是否为有毒蜂蜜，主要基于雷公藤乙素在液质上的保留时间、精确m/z值以及其特征性碎片离子的精确m/z值。
具体的，所述的采用uhplc-qexactivepuls检测蜂蜜样本的图谱中应该含有雷公藤乙素的精确m/z值：377.16003([m+h]+；c20h25o7+)，其允许偏差应在5ppm以内。
此外，为了提高有毒蜂蜜的鉴别能力，所述的雷公藤乙素的色谱峰的保留时间应该满足4.5min(允许误差应小于0.5min)。而且其ms/ms图谱(子离子图谱)中应该含有雷公藤乙素的特征碎片离子m/z211.07590(c14h11o2+)，m/z155.08608(c12h11+)，m/z167.08608(c13h11+)m/z183.08099(c13h11o+)，m/z195.08099(c14h11o+)，且其精确质量数的误差应当小于5ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值、保留时间和特征碎片离子方面同时满足雷公藤乙素的特征，方可肯定该蜂蜜样本含有雷公藤乙素，并将为归为有毒蜂蜜样本。
进一步地，在蜂蜜样本进行检测时，优选对其采用如下前处理方法：取蜂蜜样本2g加入4ml的水溶解，混匀，使蜂蜜完全溶解，然后再加10ml的乙酸乙酯，涡动3min后，6000g离心5min，取上层有机相；下层液体再次用10ml的乙酸乙酯提取一次，涡动离心同第一步，合并两次提取的有机相，在40℃水浴下，氮气吹干。然后用1ml的20％甲醇水溶解，过0.22μm的滤膜，待上机分析。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容的实质相同。
进一步地，采用uhplc-qexactiveplus对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相条件如下：
色谱柱：为c18色谱柱，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相a为0.1％的甲酸水，流动相b为0.1％的甲酸乙腈。
梯度洗脱条件为：0-1.0min，5％的b；1.0-2.0min，5-20％的b；2.0-6.5min，20-50％的b；6.5-7.0min，50-80％的b；7.0-7.1min，80-100％的b；7.1-8.5min，100％b；8.5-8.6min，100-5％的b；8.6-10min，95％的b。
流速：0.30ml/min；进样量：3.0μl。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：
鞘气的流速(sheathgasflowrate)45；辅助气的流速(auxgasflowrate)10；挡锥气的流速(sweepgasflowrate)0；电喷雾电压(sprayvoltage)3.5kv；离子导管的温度(capillarytemperature)320℃；s-lensrflevel设为60；离子源的温度(heatertemperature)350℃
采集的模式为正离子模式下的fμllms-ddms2：
其中fμllms的具体参数设置如下：分辨率(resolution)：70000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：200-800da；spectrumdata：centroid。
其中dd-ms2的具体参数设置如下：分辨率(resolution)：15000；agctarget：1.6e5；maximumit：50ms；loopcount：1；isolationwindow：2.0da；nce：42；spectrumdata：centroid。而ddsettings中，minimumagc：8.0e3；apextrigger：2-6s；excludeisotope：on；dynamicexclus：8.0s。
本发明的公布的采用uhplc-qexactiveplus仪器检测蜂蜜中的雷公藤乙素，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，其检出限可以达到2μg/kg。基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。而且，即便是在缺乏雷公藤乙素对照品的情况下，依然可以通过查看雷公藤乙素的精确质量及其特征性的碎片离子来确定蜂蜜样本中是否含有雷公藤乙素。雷公藤乙素作为雷公藤和昆明山海棠的特征性化合物，通过检测蜂蜜中是否含有雷公藤乙素来鉴别蜂蜜是否含有雷公藤有毒蜂蜜。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
附图说明
图1为雷公藤乙素的精确提取质量色谱图(rt＝5.37min)：(a)雷公藤花蜜样本；(b)有毒蜂蜜样本；(c)正常蜂蜜样本。
图2为雷公藤乙素的精确质量数的质谱图(a)及其子离子图谱(b)。
图3为雷公藤乙素的化学结构式。
图4为雷公藤鲜花中雷公藤乙素(rt＝5.37min)和雷公藤甲素的精确提取粒子流色谱图(rt＝6.72min)。
图5为雷公藤鲜花蜜雷公藤乙素(rt＝5.37min)和雷公藤甲素的精确提取粒子流色谱图(rt＝6.72min)。
图6雷公藤蜂蜜中雷公藤乙素(rt＝5.37min)和雷公藤甲素的精确提取粒子流色谱图(rt＝6.72min)：(a)来自于湖北黄石雷公藤种植基地采集的有毒蜂蜜样本；(b)来自于重庆武隆的雷公藤蜂蜜样本；(c)来自于重庆秀山的雷公藤蜂蜜样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
试验案例：
1、试验材料：雷公藤的鲜花、花蜜以及有毒蜂蜜；
其中，雷公藤的花蜜及有毒蜂蜜主要在湖北武汉黄石华润三九医药雷公藤种植基地获得。
在雷公藤的花期6月中旬至8月初，采摘雷公藤的鲜花，并采用玻璃毛细管吸取雷公藤的花蜜。此外，为了获得雷公藤的蜂蜜，在雷公藤种植基地的花期之前的5月初放置4箱蜜蜂，两箱意蜂，两箱中蜂，并且在放置之前，除去巢脾中的蜂蜜及花粉，蜂箱放置2周之后，让蜜蜂采集到足够的蜂蜜储存在巢脾中，然后每个蜂箱采集蜂蜜100-500g，巢脾中多于的蜂蜜销毁。
2、从市场或者蜂农哪里购买常见的蜂蜜样本共80份，如洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、油菜蜂蜜、荔枝蜂蜜、枣花蜂蜜、龙眼蜂蜜、椴树蜂蜜以及百花蜂蜜。
3、在2016年和2017年6月-8月份的雷公藤和昆明山海棠的花期，从已经报道过的蜂蜜中毒高发区域采集蜂蜜83份，如湖北鹤峰、利川，重庆，四川、福建泰宁，云南大理、姚安、怒江、祥云等省市。
上述采集的疑似有毒蜂蜜样本采用如下前处理方法进行处理，然后采用uhplc-qexativeplus仪器进样分析。
前处理方法具体为：取蜂蜜样本2g加入4ml的水溶解，混匀，使蜂蜜完全溶解，然后再加10ml的乙酸乙酯，涡动3min后，6000g离心5min，取上层有机相；下层液体再次用10ml的乙酸乙酯提取一次，涡动离心同第一步，合并两次提取的有机相，在40℃水浴下，氮气吹干。然后用1ml的20％甲醇水溶解，过0.22μm的滤膜，待上机分析。
至于采集雷公藤鲜花，经剪碎，组织匀浆之后，再按照上述蜂蜜样本前处理方法进行处理，然后采用uhplc-qexativeplus仪器进样分析。
雷公藤花蜜的收集量较少，未进行提取净化等措施，仅仅是将100μl的雷公藤花蜜用900μl的20％甲醇水稀释，过0.22μm的滤膜，待上机分析。
采用uhplc-qexactiveplus进行检测时，液相条件和质谱条件如本发明前述技术方案所述。
通过对比雷公藤乙素在色谱上的保留时间(rt＝5.37min)、精确质量数m/z:377.16003(见图2a)以及精确ms/ms图谱(见图2b)中主要碎片离子，确定雷公藤的花蜜和有毒蜂蜜中含有大量的雷公藤乙素。图1详细的展示了雷公藤花蜜和蜂蜜中含有雷公藤乙素，而正常蜂蜜样本中则不含有相应的色谱峰。因此，可以推断有毒蜜源植物雷公藤中的毒性物质雷公藤乙素通过蜜蜂的采蜜行为将其富集在蜂蜜中。
在湖北黄石雷公藤种植基地中采集的鲜花、花蜜和蜂蜜中除了检测到雷公藤乙素之外，还检测到了之前报道的雷公藤甲素(见图4，图5和图6a)。但是准确定量的结果表明有毒蜂蜜样本中雷公藤乙素的含量通常大于雷公藤甲素，约是雷公藤甲素的3-10倍。早期文献报道雷公藤乙素的在小鼠中急性毒性试验，其ld50为0.80mg/kgb.w.，比雷公藤甲素的0.93mg/kgb.w.较大。但是鉴于有毒蜂蜜样本中雷公藤乙素与雷公藤甲素相比，不论是在含量和毒性上均具有一定的优势。基于此，将雷公藤乙素作为雷公藤有毒蜂蜜的生物标志物更为科学合理。
为验证结论的可靠性，本发明在全国范围内采集80余份不同品种的蜂蜜样本作为空白对照，结果在采集的所有蜂蜜样本中均未检测到了雷公藤乙素。而且，本发明在2016年和2017年的雷公藤和昆明山海棠的花期，6-8月份采集了83份疑似蜂蜜样本，通过检测分析，其中30份样本中检测到了雷公藤乙素和雷公藤甲素，其中所有阳性样本中的雷公藤乙素的含量均高于雷公藤甲素3倍以上，其含量介于20-6300ug/kg。图6b和6c中展示了有蜂蜜样本中雷公藤乙素和甲素的精确提取粒子流色谱图，可见有毒蜂蜜样本中雷公藤乙素的含量高于雷公藤甲素。
由此确定，将雷公藤乙素作为雷公藤有毒蜂蜜的生物标志物更为科学合理。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。