本发明涉及保健食品中未知风险物质检测
技术领域：
，具体涉及一种保健食品中违禁药物的非目标物快速检测方法。
背景技术：
：上世纪80年代日本首先提出保健食品的概念，目前世界各国认同欧盟对保健食品的如下定义：如果能较好地确证一种食品除提供通常的营养效果之外，还能以一种促进机体健康或降低疾病风险的方式有益地影响机体中的一种或一种以上的靶功能，那么这种食品可以被认为是一种功能性食品。随着现代医学卫生技术发展，人类的寿命越来越长寿，促使人们对健康和饮食的重视，保健功能食品逐渐走入人们视线，在欧洲、北美、日本和新型发达国家与地区保健食品具有广阔的市场。在美国，消费者越来越对天然食品、有机食品和功能食品感兴趣，截止2012年，有机食品达到315亿美元市场价值。目前文献报道保健食品中违禁药物检测技术有hplc、gc-ms、lc-ms、nmr、lc-fi-icr-ms、uplc-tof-ms、ims和酶联免疫法，涉及到保健食品中违禁西药检测标准目前主要是国家食品药品监督管理局颁布食药监办许[2010]114号检测标准方法，该检测标准分别是针对14种改善睡眠类、9种辅助降血糖类、3种辅助降血脂类、3种缓解体力疲劳类和5种减肥类等34种违禁西药检测。然而已有文献研究发现保健食品中非法添加违禁药物多达几百种，常规的检测分析方法不能全部有效检测保健食品中非法添加违禁药物成分。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术不能全面检测保健食品中可能含有的违禁药物成分，在没有标准品条件下，提供一种保健食品中违禁药物的全扫描高通量快速筛查检测方法。为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种保健食品中违禁药物的非目标物快速检测方法，在已知可能添加违禁目标物西药成分，且没有标准品的条件下，按如下步骤进行：(1)样品前处理：采用quechers技术结合超声辅助萃取技术对待测保健食品进行前处理萃取，得到待机测试样液；(2)数据采集：将所述步骤(1)中的待机测试样液进行数据依存获取ida-ms或数据独立获取swath-ms高分辨质谱信息的采集；(3)对照已经建立的77种违禁药物的高分辨质谱信息数据库和通过整理常见违禁药物的masterview软件中得到的xiclist筛查列表；(4)数据分析：通过在peakview数据分析软件上处理的准确分子量、同位素分子量、分子式、色谱保留时间，以及精确二级碎片分子量，初步判断masterview违禁药物xiclist列表中可疑化合物；(5)确证：在peakview软件中输入所述步骤(4)中可疑化合物的结构式，进行高分辨质谱数据与化合物结构吻合度分析，最终鉴定保健食品中违禁药物成分。在未知添加违禁西药成分，对非目标物快速筛查的情况下：所述步骤(2)为：进行数据依存获取ida-ms和数据独立获取swath-ms高分辨质谱信息的采集模式；数据独立获取高分辨质谱信息的采集模式适合样品信息稀少以及怀疑遗漏采集数据情况下获取样品的高分辨质谱数据。所述步骤(4)为：整理可能添加违禁药物的masterview筛查列表，在peakview软件分析未知违禁药物是否在masterview筛查列表之中；若在列表之中，则进行结构式与二级精准碎片吻合度分析；若不在masterview筛查列表之中，则链接互联网查找chemspider和acs化合物结构数据库。所述步骤(5)为：将可疑化合物的一级和二级精准高分辨质谱数据，以及同位素丰度信息与chemspider和acs化合物结构数据库中化合物结构式进行匹配度分析，匹配度高的化合物即为可疑化合物；在高匹配度的条件下，还要结合化合物结构数据库的化合物基本生理医药活性判断可能添加到保健食品样品之中。优选的，所述步骤(1)中萃取条件为：向1ml或1g保健食品中加入15ml体积比为7∶3的乙腈与水的溶液、1.0g硫酸镁和0.25g氯化钠分散剂、50mg吸附剂c18和50mgpsa净化剂，涡旋1min，超声15min，离心分层后取上清液，将上清液定容至25ml，取1ml溶液过有机系滤膜后作为待机测试样液。优选的，所述步骤(2)中数据采集包括如下步骤：液相分离条件为流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，流速0.5ml/min，梯度洗脱：b相由初始体积比5％，10min增至90％，3min增至100％，保留3min，1min降至5％，保留3min，柱温40℃，c18色谱柱。优选的，所述步骤(2)中ida-ms数据采集的筛查分析条件为：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，气帘气压力：30psi，雾化气压力：40psi，加热辅助气压力：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，去簇电压：100ev，碰撞电压：10ev；二级ida-ms扫描准确质量范围：50～1000da，去簇电压：100ev，碰撞电压：35±15ev；高灵敏模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，ida实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。优选的，所述步骤(2)中swath-ms数据采集的筛查分析条件为：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，气帘气压力：30psi，雾化气压力：40psi，加热辅助气压力：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，去簇电压：100ev，碰撞电压：10ev；二级扫描每个质量窗口为20da，从100至800da，每个窗口交替重叠1da，碰撞电压：35ev，数据采集时间40ms，碰撞区间电压：15ev，高分辨模式。优选的，所述步骤(3)中masterview筛查列表中违禁药物含pde-5抑制剂类、减肥类、降血糖类、降血压类、降血脂类、风湿镇痛类和肠胃类违禁药物。本发明选择pde-5抑制剂类、减肥类、降血糖类、降血压类、降血脂类、风湿镇痛类和肠胃类等77种违禁药物成分，利用absciex5600+高分辨质谱仪，获得77种违禁药物的ida-ms和swath-ms高分辨质谱信息，建立了相应的高分辨质谱数据库，为今后保健食品非法添加违禁药物的检测分析奠定数据库支持。本发明选择减肥类、增强免疫力类、缓解疲劳类、辅助改善血糖血脂血压类等cfda审批获得市场销售各类保健食品为研究对象，整理国内外文献报告保健食品中可能非法添加违禁药物信息，具体是85种pde-5抑制剂、66种减肥类(已发表论文)、28种降血糖类、36种降血压类、17种降血脂类、54种免疫力类和46种睡眠类等违禁西药成分，以此快速筛查分析保健食品中非法添加违禁药物成分。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.高通量分析目标物：本发明建立了保健食品中常见77种违禁药物ida-ms高分辨质谱数据库，获得66种减肥类、28种降血糖类、36种降血压类、17种降血脂类、86种缓解疲劳类、54种免疫力类和46种睡眠类等违禁西药成分xiclist列表，以此为基础快速筛查鉴定保健食品中非法添加违禁药物成分。2.基质效应小：本发明采用高分辨质谱ida-ms和swath-ms的m/z全扫描模式采集数据，目标物利用提取masterviews离子流色谱图，根据高分辨一级和二级质谱定性分析。3.准确度高：本发明依据一级质谱和二级质谱的准确母离子和碎片分子量，以及同位素峰等高分辨质谱数据信息，结合chemspider化合物结构数据库，实验质谱数据与理论质谱数据进行匹配度分析，高分辨质谱数据误差在20ppm之内。4.quechers基质分散固相萃取技术与超声辅助萃取前处理方法简单，快速，准确；有效性提取获得保健食品中非法添加违禁药物成分。5.假阴性小：本发明采用ida-ms和swath-ms两种高分辨质谱数据获得方式采集，数据依存获取和数据独立获取两种方法相结合，全面获得样品中目标物质谱信息收集，降低数据遗漏丢失所造成样品检测假阴性情况。6.假阳性小：首先ida-ms和swath-ms获得一级和二级质谱数据结合chemspider结构数据库匹配分析，初步鉴定目标化合物结构式，搜索acs化学数据库，将结构式输入peakview软件之后，进行结构与质谱数据一一对应结构解析，最终鉴定判断非法添加违禁药物成分，正向和逆向两种结构解析相结合方法克服样品筛查结果假阳性情况。附图说明图1为一种减肥类保健食品的ida-ms质谱图；图2为一种减肥类保健食品的筛查分析结果；图3为一种缓解体力疲劳类保健食品的筛查分析结果；图4为某孕妇专用营养保健食品的筛查结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1：标准品条件下，保健食品中违禁药物的目标物lc-q-tof-ms高分辨质谱快速筛查检测方法的建立保健食品中违禁药物的目标物高分辨质谱快速筛查检测方法按包括如下步骤：(1)样品前处理采用quechers技术结合超声辅助萃取技术对待测保健食品进行前处理萃取，萃取条件为：向1ml或1g保健食品中加入15ml乙腈与水的溶液(体积比7∶3)，1.0g硫酸镁和0.25g氯化钠分散剂，50mg吸附剂c18和50mgpsa净化剂，涡旋1min，超声15min，离心分层后取上清液，将上清液定容至25ml，取1ml溶液过有机系滤膜后作为待机测试样液。(2)数据采集，获取样品的ida-ms或swath-ms质谱信息数据待机测试样液进行ida-ms和swath-ms数据采集：液相分离条件为流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，流速0.5ml/min，梯度洗脱：b相由初始体积比5％，10min增至90％，3min增至100％，保留3min，1min降至5％，保留3min，柱温40℃，c18色谱柱。ida-ms筛查分析条件为：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，curtaingas：30psi，离子源gas1：40psi，离子源gas2：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，dp：100ev，ce：10ev；二级ida-ms扫描准确质量范围：50～1000da，dp：100v，ce：35±15ev；高灵敏模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，ida实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。swath-ms筛查分析条件：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，curtaingas：30psi，离子源gas1：40psi，离子源gas2：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，dp：100ev，ce：10ev；二级扫描每个质量窗口为20da，从100至800da(每个窗口交替重叠1da)，ce：35ev数据采集时间40ms，ces：15ev，高分辨模式。(3)建立违禁药物xiclist筛查列表，构建数据库选择pde-5抑制剂类、减肥类、降血糖类、降血压类、降血脂类、风湿镇痛类和肠胃类等77种违禁药物成分，利用absciex5600+高分辨质谱仪，获得77种违禁药物的ida-ms和swath-ms高分辨质谱信息，建立了相应的高分辨质谱数据库，为今后保健食品非法添加违禁药物的检测分析奠定数据库支持。所建立的高分辨质谱数据库见表1。表1为违禁药物高分辨质谱数据库，由表1可见，该数据库涵盖了pde-5抑制剂类、减肥类、降血糖类、降血压类、降血脂类、风湿镇痛类和肠胃类等77种违禁药物，表2降血糖类违禁药物xiclist列表，表3降血压类违禁药物xiclist列表，表4降血脂违禁药物xiclist列表，表5改善肠胃类违禁药物xiclist列表，表6风湿免疫类违禁药物xiclist列表，表7睡眠类及其他违禁药物xiclist列表。表2表3表4表5编号中文名称英文名称分子式精确分子量1雷尼替丁ranitidinec13h22n4o3s314.141262西咪替丁cimetidinec10h16n6s252.115723瑞巴派特rebamipidec19h15c1n2o4370.072034多潘立酮domperidonec22h24c1n5o2425.161855西沙必利cisapridec23h29c1fn3o4465.183066比沙可啶bisacodvlc22h19no4361.131417莫沙必利mosapridec21h25clfn3o3421.156858大黄素甲醚emodin-3-methyletherc16h12o5284.068479大黄酚chrysophanicacidc15h10o4254.0579110大黄酸rheinc15h8o6284.0320911芦荟大黄素aloe-emodinc15h10o5270.0528212大黄素emodinc15h10o5270.0528213马兜铃酸aristolochicacidc17h11no7341.05355表6表7(4)数据分析：根据目标物的一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数以及chemspider化合物结构数据库和masterview软件初步鉴定样品。样品的ida-ms和swath-ms高分辨质谱数据分析，利用peakview数据分析软件处理获得目标物的准确分子量、同位素分子量、分子式、色谱保留时间，以及精确二级碎片分子量；结合chemspider化合物结构数据库，初步判断masterview违禁药物xiclist列表中可疑化合物。(5)确证：结合样品初步信息，搜索acs美国化学会数据库，通过acs化学数据库获得可疑化合物的结构与波谱数据，确定化合物结构式；在peakview软件中输入可疑化合物结构式，进行高分辨质谱数据与化合物结构吻合度分析，最终鉴定保健食品中未知风险西药物质成分。实施例2：在没有标准品条件下，保健食品中违禁药物的ida-ms高分辨质谱快速筛查鉴定方法的应用对市场上一批次25种减肥功能的保健食品进行抽查，调查分析此类保健食品是否存在非法添加西药的问题。(1)样品前处理25种减肥功能的保健食品样品的前处理方法按一般溶剂的提取方法进行：首先研磨制备样品，准确称量1.000g样品，加入15ml甲醇，震荡均质1min，超声15min，离心5min，转移上清液，定容至25ml，取1ml样液过0.45微米滤膜待lc-q-tof-ms高分辨质谱仪测试。(2)数据采集，获取样品的ida-ms质谱信息数据待机测试样液进行ida-ms数据采集：液相分离条件为流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，流速0.5ml/min，梯度洗脱：b相由初始体积比5％，10min增至90％，3min增至100％，保留3min，1min降至5％，保留3min，柱温40℃，c18色谱柱。ida-ms筛查分析条件为：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，curtaingas：30psi，离子源gas1：40psi，离子源gas2：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，dp：100ev，ce：10ev；二级ida-ms扫描准确质量范围：50～1000da，dp：100v，ce：35±15ev；高灵敏模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，ida实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。图1为一种减肥类保健食品的ida-ms质谱图。由图1可见，ida-ms数据依存获取采集的高分辨质谱数据信息图，数据信息量，需要借助专业数据分析软件处理获得所需要的数据。(3)数据分析：在peakview软件上，首先输入减肥类违禁药物的masterviewxiclist筛查列表，数据初步分析结果见图2，图2为一种减肥类保健食品的筛查分析结果，由图2可见，xiclist筛查列表中麻黄碱成分与采集高分辨质谱数据吻合度高，初步怀疑该样品违禁添加麻黄碱成分。(4)确证：为了确证该样品含有麻黄碱违禁药物，通过一级tof-ms和二级ida-ms数据信息，与麻黄碱结构式进行匹配度分析，二级ida-ms数据显示碎片离子峰质谱信息与麻黄碱结构式相符合，从而确证该样品中含有麻黄碱违禁药物成分。实施例3：可疑目标物条件下，保健食品中违禁药物的swath-ms高分辨质谱筛查鉴定方法的应用抽查市场上有关缓解体力疲劳功能的保健食品，文献报道显示市场上销售的缓解体力疲劳保健食品可能非法添加pde-5抑制剂类违禁药物，此类药物主要用于治疗男性功能障碍疾病，虽然短时间内对人体有着刺激兴奋作用，但长时间的使用对健康有一定的副作用，不能作为功效成分添加到保健食品，严重违反国家食品安全法。(1)样品前处理采用quechers技术结合超声辅助萃取技术对待测保健食品进行前处理萃取，萃取条件为：向1.000g保健食品中加入15ml乙腈与水的溶液(体积比7∶3)，1.0g硫酸镁和0.25g氯化钠分散剂，50mg吸附剂c18和50mgpsa净化剂，涡旋1min，超声15min，离心分层后取上清液，将上清液定容至25.00ml刻度管，取1ml溶液过有机系滤膜后作为待机测试样液。(2)高分辨质谱数据采集采用swath-ms数据独立获取方式获取样品的高分辨质谱数据。由于pde-5抑制剂类违禁药物是一类结构非常相似的同系物，文献资料显示此类违禁药物以西地那非和他达那非为母体，衍生物种类多达86种；虽然每种衍生物的作用靶点相一致，但是药理生物毒性存在差异，为了防止数据采集过程中遗漏数据，样品采用swath-ms高分辨质谱技术。图3为一种缓解体力疲劳类保健食品的筛查分析结果。由图3可见，可知该样品中可能存在乌地那非违禁药物成分。(3)数据分析：样品swath-ms高分辨质谱数据利用peakview和masterview软件相结合模式，结合chemspider化合物结构数据库和acs化学数据库，分析判断样品中非法添加违禁药物成分。在masterview软件中输入缓解体力疲劳类违禁药物xiclist列表，process处理分析样品中可疑违禁药物成分，根据masterview软件中准确质量数、同位素峰比、准确二级碎片质量数以及色谱保留时间等信息，匹配度分析样品含有可疑违禁药物，在chemspider数据库上对比分析可疑药物成分实验数据与数据库结构式匹配度。(4)确证：同时将可疑违禁药物成分输入acs化学数据库中，获得违禁药物的理化数据信息以及结构式mol格式文件，违禁药物的结构式mol格式文件输入peakview软件，进行化合物结构式理论断裂碎片信息与实验碎片信息相符性分析，再判断确证样品中违禁药物成分。该缓解体力疲劳保健食品样品通过上述正向和逆向两种质谱数据与结构式匹配度分析鉴定样品中含有乌地那非违禁药物成分。实施例4：未知样品信息条件下，保健食品中违禁药物的非目标物高分辨质谱筛查鉴定方法的应用为了筛查分析市场声称针对某类人群具有特殊功能作用的保健食品的安全性问题，本实施例抽查分析市场销售针对孕妇营养作用的保健食品，此类保健食品安全问题直接关系到下一代人健康。对于此类保健食品样品采用目标物分析和非目标物分析两种数据处理方法，全面分析样品中含有违禁药物成分。(1)样品前处理：准确称量1.000g样品，采用quechers技术结合超声辅助萃取技术对待测保健食品进行前处理萃取，萃取条件为：向样品中加入15ml乙腈与水的溶液(体积比7∶3)，1.0g硫酸镁和0.25g氯化钠分散剂，50mg吸附剂c18和50mgpsa净化剂，涡旋1min，超声15min，离心分层后取上清液，将上清液定容至25.00ml刻度管，取1ml溶液过有机系滤膜后作为待机测试样液。(2)数据采集液相分离条件为流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，流速0.5ml/min，梯度洗脱：b相由初始体积比5％，10min增至90％，3min增至100％，保留3min，1min降至5％，保留3min，柱温40℃，c18色谱柱；ida-ms筛查分析条件为：esi和apci复合源；正离子扫描方式；apci源连接自动校正系统，样品为esi离子化方式，curtaingas：30psi，离子源gas1：40psi，离子源gas2：50psi，离子源温度450℃，离子源电压5500v；一级tof-ms扫描准确质量范围：100～1000da，数据采集时间100ms，dp：100ev，ce：10ev；二级ida-ms扫描准确质量范围：50～1000da，dp：100v，ce：35±15ev；高灵敏模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，ida实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。(3)数据分析首先根据样品提供的信息进行目标物分析，未发现可疑成分时，再采用未知物全扫描分析处理数据原则，样品标签声称此保健食品具有增强机体免疫力功能，在masterview软件选择目标物分析功能，输入增强免疫力类违禁药物xiclist筛查列表，依据一级质谱和二级质谱的准确母离子和碎片分子量，以及同位素峰等高分辨质谱数据信息，未发现样品中可疑免疫类药物成分。于此在masterview软件选择另外一种非目标物分析功能，全面扫描分析模式处理样品中可疑非法添加违禁药物成分，在软件上设置质谱信息阈值，非目标分析处理数据扫描速率，化合物元素组成和准确质量数允许10ppm误差，结果如图4所示，图4为某孕妇专用营养保健食品筛查结果，4a部分所示发现可疑违禁药物药物成分，4b所示结合chemspider化合物结构数据库判断样品中违禁药物成分。由图4可见，采用非目标物分析功能发现样品中存在布洛芬违禁药物，与一级质谱和二级质谱的准确母离子和碎片分子量，以及同位素峰等高分辨质谱数据信息高度匹配，同时结合布洛芬药效功能是抗炎、解热和镇痛作用，最终确定该孕妇服用保健食品样品中非法添加布洛芬违禁药物。当前第1页12