稀土配合物荧光探针及其对环境样品中总磷的检测方法与流程

本发明涉及水样与大气颗粒物中总磷的检测方法，具体涉及一种稀土配合物荧光探针及其对环境样品中总磷的检测方法，属于环境监测技术领域。

背景技术：

水中磷可能以元素磷、正磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐和有机磷等形式存在。其主要来源为生活污水、化肥、有机磷农药及近代洗涤剂所用的磷酸盐增洁剂等。水体中的磷是藻类生长需要的一种关键元素，过量磷是造成水体污秽异臭，使湖泊发生富营养化和海湾出现赤潮的主要原因。总磷是水样经消解后将各种形态的磷转变成正磷酸盐后测定的结果，以每升水样含磷毫克数计量。

目前测定水样总磷的方法有：钼酸铵分光光度法，其最低检出浓度为0.01mg/l；流动注射-钼酸铵分光光度法，其检出限为0.005mg/l。离子色谱法测定可溶性磷酸盐的方法检出限为0.007mg/l。目前水样总磷的测定方法，灵敏度总体不够高，勉强能满足水体总磷测定的需求，而且分光光度法还存在共存基体干扰的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中水样总磷测定灵敏度不高且存在共存基体干扰的问题，并提供一种稀土配合物荧光探针及其对环境样品中总磷的检测方法。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种稀土配合物荧光探针，用于测定样品中正磷酸盐含量，该荧光探针是由环丙沙星和eu³⁺在ph＝6.5～8.5溶液体系中形成的配合物。

当正磷酸盐加入含有该配合物的溶液体系后，原本被eu³⁺完全淬灭的环丙沙星的荧光得到部分的恢复，且正磷酸盐浓度越高恢复程度也相应提升。在一定的范围内，磷酸根浓度和环丙沙星的荧光强度呈良好的线性关系，可用于准确检测磷酸根浓度。

作为优选，在该溶液体系中，eu³⁺与环丙沙星的摩尔浓度比为(3～1):1。

在另一方案中，形成该配合物的溶液体系中还含有十二烷基苯磺酸钠，即该荧光探针是由环丙沙星、eu³⁺和十二烷基苯磺酸钠在ph＝6.5～8.5溶液体系中形成的配合物。十二烷基苯磺酸钠的作用是增强eu³⁺与环丙沙星配合物的形成从而提高检测灵敏度。

作为优选，在该溶液体系中，eu³⁺、环丙沙星与十二烷基苯磺酸钠的摩尔浓度比为(3～1)：1：(5～75)。

本发明的另一目的在于提供一种稀土配合物荧光探针对样品中正磷酸盐含量的检测方法，其具体方案包括两种：

方案一为：将摩尔比为(3～1):1的环丙沙星和eu³⁺溶解于ph＝6.5～8.5的缓冲溶液体系中，混匀静置形成配合物荧光探针后，加入含正磷酸盐的样品，混匀定容；然后将混合溶液置于激发波长下照射，再于发射波长处测定溶液的荧光强度；最后根据标准曲线换算得到样品中正磷酸盐含量。

方案二为：将摩尔比为(3～1)：1：(5～75)的eu³⁺、环丙沙星与十二烷基苯磺酸钠溶解于ph＝6.5～8.5的缓冲溶液体系中，混匀静置形成配合物荧光探针后，加入含正磷酸盐的样品，混匀定容；然后将混合溶液置于激发波长下照射，再于发射波长处测定溶液的荧光强度；最后根据标准曲线换算得到样品中正磷酸盐含量。

其中，方案二相对于方案一在检测溶液体系中增加了十二烷基苯磺酸钠，其可以提高检测的灵敏度，具体效果将通过后续实施例予以说明。

上述两种检测方案中，激发波长可以为310～350nm，发射波长可以为380～450nm。该波段下，荧光强度较高，能够提高检测灵敏度。

上述两种检测方案中，缓冲溶液体系可以为氨基乙酸缓冲溶液。当然，缓冲溶液体系的作用是为了控制检测体系的ph，因此其他不会对测定造成干扰的缓冲溶液也同样适用，不作为限定。

上述两种检测方案中，原始的待测样品可以是含磷水样，也可以是颗粒物样品，例如从大气中采集的tsp和pm2.5颗粒物。但两种检测方案中，能检测的磷形态是溶解性正磷酸盐，因此加入检测体系的样品均是含有正磷酸盐的样品。当要检测样品中总磷或者其他非溶解性磷酸盐含量时，须事先对样品进行消解，将其转化为溶解性正磷酸盐。

当待测样品为含磷水样时，含磷水样预先经过消解预处理，然后定量取消解液定容作为所述含正磷酸盐的样品。

当待测样品为为含磷颗粒物时，含磷颗粒物预先在酸溶液中进行消解，然后定量取消解液定容作为所述含正磷酸盐的样品。

本发明的稀土配合物荧光探针对正磷酸盐测定具有极高的灵敏度，方法的检出限最高达4.6nm，能够用于痕量正磷酸盐浓度检测。

附图说明

图1为实施例1中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下环丙沙星(cip)的荧光光谱，(c)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(d)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图2为实施例2中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(c)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图3为实施例3中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(c)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图4为实施例4中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(c)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图5为实施例5中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(c)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图6为实施例6中不同处理下的荧光光谱；其中：(a)环丙沙星(cip)的荧光光谱，(b)cip-eu³⁺配合物的荧光光谱,(c)10.0μmol·l^-1磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱；

图7为不同磷酸根浓度下的荧光光谱；其中，最上方的曲线代表4.0μm磷酸根浓度下的荧光光谱，下方的曲线对应的磷酸根浓度依次递减，最下方的曲线代表0.05μm磷酸根浓度下的荧光光谱；

图8为水样中共存的阴阳离子与黄腐酸对检测的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明的方法既可以用于直接检测直接存在于样品中的正磷酸盐，也可以将样品消解后测定总磷，其原理是一致的。下面以后者为例，说明本发明的具体实现过程及效果。

本发明中，基于共振能量转移的稀土离子配合物荧光探针灵敏、选择性检测环境样品(水样与大气颗粒物中)中总磷的分析方法，其优实现方式包括以下步骤：

(1)预处理：

水样的预处理：取采集水样25ml于50ml锥形瓶中，加入3ml浓硝酸和数粒沸石，摇匀之后在电热板上加热浓缩至10ml，如水样仍然浑浊，再加入2ml浓硝酸继续加热，直至水样变得澄清透明为止，继续加热水样至近干，冷却后加入10ml高纯水溶解残余物，并用1.0mol/lnaoh溶液调水样ph至中性，然后将其转移至25ml比色管中，用高纯水定容至刻度。

大气颗粒物样品的预处理：将采集的tsp和pm2.5颗粒物分别转移至两个50ml锥形瓶中，各加入几粒沸石，然后分别加入10ml高纯水，摇匀后再加入1ml浓硝酸，在加热板上加热煮沸至近干，冷却之后再加入7ml高纯水溶解残余物，并用1.0mol/l的naoh溶液调水样ph至中性，然后将其转移至10ml比色管中，用高纯水定容至刻度。

(2)检测实验方法：在10.0ml比色管中，依次加入一定量的如下溶液：氨基乙酸缓冲溶液,环丙沙星(cip)溶液，eu(no3)3溶液,十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，混匀后静置10min。再加入一定量的磷酸钠溶液(或待测样品)，然后稀释定容至10.0ml，上述溶液的最终浓度为：5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝6.5～8.5)，缓冲体系中eu(no3)3与环丙沙星摩尔浓度比为3:1～1:1(环丙沙星溶液浓度为10μm)，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)摩尔浓度为0.5～7.5×10^-4mol/l。混匀后室温下放置10min，在激发波长310～350nm，发射波长380～450nm处测定溶液的荧光强度。最佳优化实验条件为：5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5),eu(no3)3溶液与环丙沙星溶液浓度比为1.5:1(环丙沙星溶液浓度为10μm),十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)为1.0×10^-4mol/l，混匀后室温下放置10min，在激发波长330nm，发射波长415nm处测定溶液的荧光强度。

(3)标准工作曲线的绘制：取7支10.0ml比色管，平行依次加入如下溶液：500μl1.0mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5),100μl1.0×10^-3mol/l环丙沙星，30μl5.0×10^-3mol/leu³⁺,100μl1.0×10^-2mol/lsdbs，混匀后静置10min。再在7支比色管中分别加入0、50、100、200、300、400、500μl一定浓度的磷酸钠标准溶液，然后稀释定容至10.0ml，混匀后室温下放置10min，在激发波长330nm，发射波长415nm处测定溶液的荧光强度。按测得溶液的荧光强度和对应加入的磷酸根浓度绘制标准工作曲线。

(4)样品浓度测定：经过预处理的水样或颗粒物样品，按实验步骤(2)测得相应的荧光强度，把测得的荧光强度通过(3)获得的标准工作曲线计算得到相应磷酸根浓度，再根据样品前处理或测定过程中的稀释倍数计算样品实际浓度。

实施例1

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5)中，加入eu(no3)3溶液、环丙沙星溶液和十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为15μm，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)浓度为1.0×10^-4mol/l。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于330nm激发波长下照射，即可在发射波长(最佳为415nm)下检测溶液的荧光强度。

为了展现本实施例中，荧光探针的原理以及各组分在体系中所起的作用，还分别对环丙沙星(cip)、加入磷酸根的环丙沙星以及环丙沙星-eu³⁺配合物在相同激发波长下的荧光光谱进行了测定。其结果见图1所示的荧光光谱，从图中可以看出，在eu³⁺不存在的情况下，10μm的环丙沙星(cip)在415nm处有较强的荧光强度(图1.a)，并且加入10μm磷酸根之后，环丙沙星荧光强度几乎没有变化(图1.b)，当加入15μm的eu³⁺之后，环丙沙星的荧光峰几乎被完全淬灭，而eu³⁺离子615nm处的特征荧光被明显增强(图1.c)，这是由于eu³⁺的加入形成了环丙沙星-eu³⁺配合物，发生了环丙沙星向eu³⁺离子之间的能量转移，从而使环丙沙星本身的荧光强度大大降低，而增强了eu³⁺的特征荧光。当向环丙沙星-eu³⁺配合物体系中加入10μm磷酸根之后，可以发现环丙沙星的荧光得到部分的恢复，而eu³⁺的特征荧光又明显降低(图1.d)，这可能是由于eu³⁺能与磷酸根结合，从而削弱了环丙沙星向eu³⁺离子之间的能量转移，使环丙沙星的荧光得以部分恢复。这一荧光淬灭和荧光恢复过程可以在紫外灯照射下进行裸眼观察。

在本实施例的实验条件下，环丙沙星-eu³⁺配合物体系与磷酸根浓度的关系如图7，随着磷酸根浓度的增加，配合物体系环丙沙星本身的荧光强度逐渐恢复，在0.05～4.0μm的浓度范围内，磷酸根浓度和环丙沙星的荧光强度呈良好的线性关系(f-f0)/f0＝0.116c+0.0273，r²＝0.994，方法的检出限达4.6nm，表明方法的灵敏度很高，比目前已报道的方法要明显高。

实施例2

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝6.5)中，加入eu(no3)3溶液、环丙沙星溶液和十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为30μm，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)浓度为0.5×10^-4mol/l。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于310nm激发波长下照射，即可在发射波长下检测溶液的荧光强度。在该溶液体系中，磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱如图2.c所示，而单独的环丙沙星荧光光谱如图2.a所示，该溶液体系加入磷酸根之前的cip-eu³⁺配合物荧光光谱如图2.b所示。

利用本实施例中检测体系检测磷酸根的检出限为0.75μm。

实施例3

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝8.5)中，加入eu(no3)3溶液、环丙沙星溶液和十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为10μm，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)浓度为7.5×10^-4mol/l。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于310nm激发波长下照射，即可在发射波长下检测溶液的荧光强度。在该溶液体系中，磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱如图3.c所示，而单独的环丙沙星荧光光谱如图3.a所示，该溶液体系加入磷酸根之前的cip-eu³⁺配合物荧光光谱如图3.b所示。

利用本实施例中检测体系检测磷酸根的检出限为0.5μm。

实施例4

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝6.5)中，加入eu(no3)3溶液、环丙沙星溶液和十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为10μm，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)浓度为7.5×10^-4mol/l。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于350nm激发波长下照射，即可在发射波长下检测溶液的荧光强度。在该溶液体系中，磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱如图4.c所示，而单独的环丙沙星荧光光谱如图4.a所示，该溶液体系加入磷酸根之前的cip-eu³⁺配合物荧光光谱如图4.b所示。

利用本实施例中检测体系检测磷酸根的检出限为0.25μm。

实施例5

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝8.5)中，加入eu(no3)3溶液、环丙沙星溶液和十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为30μm，十二烷基苯磺酸钠溶液(sdbs)浓度为0.5×10^-4mol/l。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于350nm激发波长下照射，即可在发射波长下检测溶液的荧光强度。在该溶液体系中，磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱如图5.c所示，而单独的环丙沙星荧光光谱如图5.a所示，该溶液体系加入磷酸根之前的cip-eu³⁺配合物荧光光谱如图5.b所示。

利用本实施例中检测体系检测磷酸根的检出限为1.0μm。

实施例6

本实施例中，在5.0×10^-2mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5)中，加入eu(no3)3溶液和环丙沙星溶液，保持混合液中环丙沙星溶液浓度为10μm，eu³⁺浓度为15μm。混合溶液静置10min后，形成环丙沙星-eu³⁺配合物。将磷酸钠溶液加入该混合溶液中，保持溶液中磷酸根浓度为10μm，将混合液置于330nm激发波长下照射，即可在发射波长(最佳为415nm)下检测溶液的荧光强度。

在该溶液体系中，磷酸根存在下cip-eu³⁺配合物的荧光光谱如图6.c所示，而单独的环丙沙星荧光光谱如图6.a所示，该溶液体系加入磷酸根之前的cip-eu³⁺配合物荧光光谱如图6.b所示。

利用本实施例中检测体系检测磷酸根的检出限为0.25μm。与实施例1相比，本实施例中没有添加十二烷基苯磺酸钠溶液，总体灵敏度有明显下降。

实施例7

本实施例用于验证实施例1中检测体系的方法选择性。

在实施例1中的实验参数下，试验了磷酸根与其它可能共存的阴阳离子以及水样中大量存在的黄腐酸对体系测定荧光强度的干扰情况。试验过程中，保持不同阴阳离子或黄腐酸与磷酸根的摩尔比均为1:1(摩尔浓度均为8.0μm)，结果如图8所示，除了cr³⁺略有干扰外，其它可能共存的阴阳离子与黄腐酸几乎都不干扰测定，表明该方法具有良好的选择性。

实施例8

本实施例用于验证实施例1中检测体系的方法准确性。基于稀土离子配合物荧光探针检测水样中总磷的分析方法具体步骤如下：

(1)水样的预处理：取采集水样25ml于50ml锥形瓶中，加入3ml浓硝酸和数粒沸石，摇匀之后在电热板上加热浓缩至10ml，如水样仍然浑浊，再加入2ml浓硝酸继续加热，直至水样变得澄清透明为止，继续加热水样至近干，冷却后加入10ml高纯水溶解残余物，并用1.0mol/lnaoh溶液调水样ph至中性，然后将其转移至25ml比色管中，用高纯水定容至刻度。

(2)实验步骤：在10.0ml比色管中，依次加入如下溶液：500μl1.0mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5),100μl1.0×10^-3mol/l环丙沙星，30μl5.0×10^-3mol/leu³⁺,100μl1.0×10^-2mol/lsdbs，混匀后静置10min。再加入一定量的待测样品，然后稀释定容至10.0ml，混匀后室温下放置10min，在激发波长330nm，发射波长415nm处测定溶液的荧光强度。

(3)标准工作曲线的绘制：取7支10.0ml比色管，平行依次加入如下溶液：500μl1.0mol/l氨基乙酸缓冲溶液(ph＝7.5),100μl1.0×10^-3mol/l环丙沙星，30μl5.0×10^-3mol/leu³⁺,100μl1.0×10^-2mol/lsdbs，混匀后静置10min。再在7支比色管中分别加入0、50、100、200、300、400、500μl一定浓度的磷酸钠标准溶液，然后稀释定容至10.0ml，混匀后室温下放置10min，在激发波长330nm，发射波长415nm处测定溶液的荧光强度。按测得溶液的荧光强度和对应加入的磷酸根浓度绘制标准工作曲线。

(4)样品浓度测定：经过预处理的水样或大气样品，按实验步骤(2)测得相应的荧光强度，把测得的荧光强度通过实验步骤(3)获得的标准工作曲线计算得到相应磷酸根的浓度，再根据样品前处理或测定过程中的稀释倍数计算样品的实际浓度。

将上述测定方法与国标的磷钼蓝分光光度法分别对相同的湖水与废水样品中总磷浓度进行测定，检测结果如表1所示，从表中可见，两种方法测定结果基本一致。

表1水样总磷测定方法比对

实际样品测定应用：将本发明方法应用于地表水、污水样品与大气颗粒物样品测定。水样的预处理如上所述。大气颗粒物样品的预处理如下：将采集的tsp和pm2.5颗粒物分别转移至两个50ml锥形瓶中，各加入几粒沸石，然后分别加入10ml高纯水，摇匀后再加入1ml浓硝酸，在加热板上加热煮沸至近干，冷却之后再加入7ml高纯水溶解残余物，并用1.0mol/l的naoh溶液调水样ph至中性，然后将其转移至10ml比色管中，用高纯水定容至刻度。

各水样和大气颗粒物的总磷测定结果如表2、表3所示。

表2实际水样总磷测定

表3大气颗粒物总磷测定

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。例如，上述实施例中，均采用氨基乙酸缓冲溶液，但事实上该缓冲溶液仅起到稳定ph的作用，只要采用不会干扰测定的缓冲溶液均可；上述实施例中，均采用十二烷基苯甲酸钠溶液，但事实上该表面活性剂仅起对测定体系有增敏作用，只要采用不会干扰测定的其它表面活性剂也可。样品的预处理需要根据实际检测目的而定，可以进行也可以不进行。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。