本发明涉及花粉分析领域，具体涉及采用气相色谱技术分析花粉挥发性有机物，对花粉种属及花粉挥发性有机物进行的定性检测方法。
背景技术：
：随着工业化进程加快和(人民)生活方式的改变，吸入性过敏原所引起的过敏反应发病率显著增加，严重影响受累人口的生活质量、工作效率，加重患者经济负担。过敏性疾病是临床上的常见病、多发病，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的3大疾病之一。过敏性疾病从新生儿到老年人的各年龄阶段均可能发生，且有明显的遗传性倾向。过敏性疾病主要包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎、过敏性结膜炎，甚至会引发过敏性休克。人体首次食入或吸入过敏原后，诱导b细胞产生特异性抗体sige。sige与肥大细胞以及嗜碱性粒细胞表面受体牢固结合。当过敏原再次进入体内时，与这些sige相互结合。这种结合会诱导与sige结合的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放多种介质，如挥发性有机物或脂质，在这些物质的作用下，均可引起平滑肌收缩、毛细血管扩张、毛细血管通透性增强，腺体分泌物增多等反应，最终导致过敏。“花粉症”泛指由花粉引起的临床过敏症状，包括季节性过敏性鼻炎和过敏性哮喘。花粉主要是通过植物蛋白质发挥致敏作用的。花粉的体积很小，直径在20～40μm，漂浮在空气中，在授粉季节空气中花粉含量很高，极易随呼吸系统进入人体引起过敏。春季以圆柏属、英国梧桐属、洋白蜡属以及白桦属等致敏性强的植物花粉居多；秋季以葎草属、蒿属、豚草属以及地肤花粉等致敏性强的草本植物花粉较多。花粉中含有色素、维生素、酶、多糖和蛋白质等多种组分，其主要变应原通常是水溶性蛋白质或分子质量为10～70kda的糖蛋白。过敏性疾病的治疗方法主要有对症药物治疗与特异性免疫性治疗，现有的对症药物主要包括抗组胺药物，过敏反应介质阻滞剂、免疫抑制剂等。特异性免疫治疗属于对因治疗，是一种脱敏治疗手段，目前脱敏治疗是唯一可以改变过敏性疾病自然进程的治疗方法。花粉粒不仅是过敏原的载体，也富含多种生物活性脂质，可诱导中性粒细胞和嗜酸粒细胞等参与过敏性炎症。其中一些可挥发性小分子能起到活化tlr、促进过敏性炎症发生的作用。在过敏原或感染原暴露情况下，树突状细胞上表达的tlr可通过调节dc功能直接调控t细胞的极化状态，进而参与预防或促进过敏反应的发生过程，其中tlr2、tlr4对th1及th2极化都具有重要作用。因此，除常规的花粉致敏蛋白外，一些可挥发性有机物、小分子等也可能参与了过敏的病理生理机制，而不同种属花粉可挥发性小分子经广谱筛选，可能具有种属特异性。因此将其作为分子标记来辨识花粉可能具有一系列潜在优势。目前，对于花粉粒的鉴别主要采用显微鉴别法，根据花粉粒的显微特征鉴别不同来源的花粉，但花粉显微镜鉴别法会破坏花粉样品，而且耗时很长，需要训练有素的技术人员。因此，有必要提供一种花粉种属及花粉挥发性有机物的定性检测方法。技术实现要素：本发明针对现有技术中花粉粒鉴定过程中耗时长以及会对花粉样品产生破坏的问题，提供一种花粉种属及花粉挥发性有机物的定性分析检测方法。该方法采用气相离子迁移色谱检测花粉的挥发性有机物，从而避免以上缺点，实现快速、自动化、高通量的检测鉴别方法，大大提高了鉴别效率。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种花粉种属的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：(1)称取花粉样品后，分别置于顶空进样瓶中；(2)常温下挥发，将挥发的气体作为待分析的样品；(3)采用气相离子迁移色谱仪对步骤(2)中的样品进行电离检测；(4)根据保留指数、迁移速率和离子峰的强度进行三维定性，绘制谱图；(5)将样品的谱图和花粉标准品的谱图进行比对，得到鉴定结果；也可分析花粉特异性挥发性有机物，通过对其特异性挥发性有机物进行分析，即可分析出花粉的种类；优选的，步骤(1)中所述花粉标准品和样品的重量分别为0.800g-1.200g。优选的，步骤(2)中的挥发时间是0.5-1.5小时。优选的，所述花粉选自包含且不限于以下花粉：地肤花粉、大籽蒿花粉、豚草花粉、黄花蒿花粉、葎草和沙蒿花粉中的任一一种。本发明进一步提供了一种花粉种属标准谱图的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(1)收集纯度高、杂质少的花粉样品，称取花粉样品后，分别置于顶空进样瓶中；(2)常温下挥发，将挥发的气体作为待分析的样品；(3)采用气相离子迁移色谱仪对步骤(2)中的样品进行电离检测；(4)根据保留指数、迁移速率和离子峰的强度进行三维定性，绘制谱图。优选的，步骤(1)中所述花粉标准品的重量为0.800g-1.200g。优选的，步骤(2)中的挥发时间是0.5-1.5小时。优选的，所述花粉选自包含且不限于以下花粉：地肤花粉、大籽蒿花粉、豚草花粉、黄花蒿花粉、葎草和沙蒿花粉中的任一一种。本发明进一步提供花粉种属的标准谱图，所述谱图采用上述方法制备得到。本发明进一步提供一种花粉挥发性有机物的鉴定方法。每种花粉都会散发出不同有机挥发性气体，这些有机挥发性气体对过敏性疾病的影响目前尚不清楚。因此，对花粉挥发性气体进行定性和定量检测，有助于进一步研究分析花粉的致病机理。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种花粉挥发性有机物的鉴定和定量方法，其特征在于，所述方法包括：(1)称取花粉样品，置于顶空进样瓶中；(2)常温下挥发，将挥发性的气体作为待分析的样品；(3)采用气相离子迁移色谱仪对步骤(2)中的样品进行电离检测；(4)根据保留指数、迁移速率和离子峰的强度进行三维定性，绘制谱图；(5)通过与挥发性有机物标准图谱比较分析，根据保留指数、迁移速率以及离子的峰强度实现对花粉有机物挥发性气体的定性分析；通过与挥发性有机物的标准品峰值比较分析，实现对花粉中挥发性有机物的定量分析。优选的，步骤(1)中所述花粉标准品和样品的重量分别为0.800g-1.200g。优选的，步骤(2)中的挥发时间是0.5-1.5小时。优选的，所述花粉选自包含且不限于以下花粉：地肤花粉、大籽蒿花粉、豚草花粉、黄花蒿花粉、葎草和沙蒿花粉中的任一一种。优选的，所述方法包括对不同年限、不同地区以及脱脂前后的花粉的挥发性有机物进行检测。本发明的另外一个目的是建立花粉挥发性有机物标准图谱库。本发明的另外一个目的是根据花粉标准性图谱，结合花粉挥发性有机物的气相保留指数以及在电场中的离子迁移时间检测花粉的挥发性有机物的种类。本发明的另外一个目的是根据图谱峰面积的不同定量分析花粉的挥发性有机物。本发明的另外一个目的是根据不同花粉挥发性有机物之间的共性和差异性可以区分出不同季节、不同种属的花粉。本发明的另外一个目的是用于原料处理过程中的实时在线监测，比如根据花粉脱脂前后挥发性有机物的差异可以判定是否脱脂充分完全。本发明采取常温下花粉的挥发性气体作为样品，使用气相离子迁移色谱仪，在经气相色谱柱分离后，气体进入离子迁移谱检测器，被电离检测。根据不同挥发性有机物之间保留时间、离子迁移时间的不同以及离子峰强度的不同，对其进行定性和相对定量分析。解决了花粉种属鉴定以及挥发性有机物的定性和定量分析的问题。本方法鉴定的时间短，自动化程度高，准确性高，可以实现对花粉样品高通量的检测分析，大大提高了鉴定分析的效率。附图说明图1.葎草花粉挥发性有机物的标准图谱。图2.黄花蒿花粉挥发性有机物的标准图谱。图3.四种秋季花粉样品之间的谱图差异分析--谱图直接对比。从左到右依次为豚草-1，大籽蒿-1，地肤-1，地肤-2和葎草-1。图4.四种秋季花粉样品之间的谱图差异分析--差异对比，从左到右依次为豚草-1，大籽蒿-1，地肤-1，地肤-2和葎草-1。图5.三种花粉的二维俯视图，从左到右依次为hhh-1，hhh-2，dzh-1，dzh-2，sh-1和sh-2。图6.三种花粉的三维谱图，从左到右依次为hhh，dzh，sh。图7.三种花粉的三维谱图的下部分放大图。从左到右依次为hhh，dzh，sh。图8.谱图中信号峰的选取示意图，以葎草花粉为例。图9.四种秋季花粉挥发性有机物的指纹图谱，从上到下依次为tun-1，tun-2，dzh-1，dzh-2，df-1，df-2，lv-1，lv-2。图10.三种蒿属花粉挥发性有机物之间的差异分析，从上到下依次为hhh-1，hhh-2，dzh-1，dzh-2，sh-1，sh-2。图11.葎草花粉挥发性有机物的定性分析图12.黄花蒿花粉挥发性有机物定性分析。图13.大籽蒿花粉挥发性有机物定性分析。图14.沙蒿花粉挥发性有机物定性分析。图15.四种秋季花粉样品分类以及快速确定。具体实施方式(1)称取花粉样品0.800g-1.200g；(2)直接置于20ml顶空进样瓶中；(3)常温下挥发0.5-1.5小时后的挥发性气体作为样品；(4)气相离子迁移色谱仪根据其保留指数的不同以及在电场中离子迁移速率的不同将花粉挥发性有机物进行分离并检测；(5)分析结果。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。lv代表葎草花粉，df代表地肤花粉，hao代表大籽蒿花粉，tun代表豚草花粉，hhh代表黄花蒿花粉，sh代表沙蒿花粉。数字1和2分别代表平行的花粉样品。实施例1花粉挥发性有机物的检测方法和原理使用气相离子迁移色谱仪，该仪器在无需真空且无需样品前处理前提下，经顶空进样后可快速检测花粉中的挥发性有机物，结合相关插件以及软件内置的nist气相保留指数数据库及ims数据库，根据不同挥发性有机物之间保留时间、离子迁移时间的不同以及离子峰强度的不同对不同花粉分别进行检测。其特征在于，所述方法包含以下步骤：花粉挥发性有机物样品的制备步骤：(1)称取花粉样品1.000g；(2)直接置于20ml顶空进样瓶中；(3)常温下挥发1小时后的挥发性气体作为样品；(4)气相离子迁移色谱仪根据其保留指数的不同以及在电场中离子迁移速率的不同将花粉挥发性有机物进行分离并检测；(5)分析结果。样品进样、分离与检测步骤：(1)样品经载气n2被载入色谱柱中，根据每种挥发性有机物在色谱柱中保留时间的不同进行分离；(2)经分离后，样品和n2进入气相离子迁移谱检测器，主要由反应区、电离源、离子门、迁移区和法拉第盘检测器组成。样品进入反应区，在氚源的作用下，挥发性有机物被电离，离子化的样品再根据其在电场中迁移时间的不同继续进行分离检测；电离机制如下：n2+β→n2++β+e-n2++2n2→n4++n2n4++h2o→2n2+h2o+h2o++h2o→h3o++ohh3o++h2o+n2→(h2o)2h++n2(h2o)2h++h2o+n2→(h2o)3h++n2在正离子(h2o)xh+模式下，分析物会与(h2o)xh+争夺h+，机制如下：(h2o)xh++a→ah++xh2o(h2o)xh+会形成rip反应离子峰，其余ah+会根据在电场中迁移时间的不同分别在rip峰两侧形成反应离子峰。通过保留时间和迁移时间、以及离子峰强度进行三维定性，通过仪器配套的分析软件包括lav(laboratoryanalyticalviewer)和三款插件以及gc×imslibrarysearch，可以分别从不同角度进行样品分析。(1)lav：用于查看分析谱图，图中每一个点代表一种挥发性有机物；对其建立标准曲线后可进行定量分析；(2)reporter插件：用于进行少量样品之间的差异分析；(3)galleryplot插件：用于进行大量样品之间的差异分析；(4)dynamicpca插件：动态主成分分析，用于将样品进行分类，以及快速确定未知样品的种类；(5)gc×imslibrarysearch：应用软件内置的nist数据库和ims数据库可对物质进行定性分析，也可根据花粉挥发性有机物标准品自行扩充数据库，实现对花粉挥发性有机物的定性和定量分析，进而分析出花粉挥发性有机物的成分及其之间的差异。实施2花粉挥发性有机物标准图谱的建立分别以葎草、黄花蒿的花粉作为待检测的样品，按照实施例1中的方法进行检测，绘制谱图。其中，葎草花粉挥发性有机物的标准图谱如图1所示。黄花蒿花粉挥发性有机物的标准图谱如图2所示。图1和图2中：a.纵坐标代表气相色谱的保留时间，横坐标代表离子迁移时间；b.整个图背景为黑色，横坐标1.0处竖线为rip峰(反应离子峰，经归一化处理)；c.rip峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，黑色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。实施例3少量花粉样品之间的差异分析1.四种秋季花粉样品之间的差异分析(1)谱图直接对比：直观观察样品谱图之间的区别，如图3所示。其中，图3从左到右依次为豚草-1，大籽蒿-1，地肤-1，地肤-2和葎草-1，从图中可以看出，不同花粉之间差异很大，而地肤的两个平行样之间相似度很高。(2)差异对比：选取一张谱图作为参比，所有图扣减这张谱图，扣减后的谱图中，背景越干净，表示和参比的相似度越好，图上的颜色深浅表示该物质浓度，颜色越深表明比参比中高，颜色越浅表示该物质浓度比参比中低。图4中，以地肤-1作为参比，同样可以看出不同花粉之间差异很大，而地肤的两个平行样之间相似度很高。2.三种蒿属花粉之间的差异分析图5为三种花粉的二维俯视图，从左到右依次为黄花蒿-1，黄花蒿-2，大籽蒿-1，大籽蒿-2，沙蒿-1和沙蒿-2，可以看出，不同花粉之间差异很大，而两个平行样之间相似度很高。去掉平行样，每种样品仅取一个进行三维谱图对比，结果如图6所示。将三种花粉的三维谱图的下半部分进一步进行方法显示，结果如图7所示。从上面的三维图也很容易看出三种花粉之间的差异很大。实施例4花粉挥发性有机物的分析(指纹图谱)1.四种秋季花粉之间的差异分析(1)首先在谱图上选取信号峰，如图8以及图13、图14所示，将关注的峰用方框圈起来(下图仅为示例，选取的峰越多，越能真实反映样品的信息)；(2)选择需要对比的花粉挥发性有机物的峰图，系统自动生成指纹图谱，结果如图9所示。从图9中可以看出每种花粉都有独特的挥发性有机物，例如豚草中的cyclohexanone等物质(图9上部分第一个框)；地肤中的1-pentanol和2-heptanone等物质(图9上部分第三个框)，另外大籽蒿和葎草中也都含有特异性物质，分别见图9上部分第二个框和图9下部分第一个框。根据这些特异性的挥发性有机物结合不同花粉标准谱图，可实现对不同年限、不同区域、不同季节、不同种属花粉的鉴定。2.三种蒿属花粉挥发性有机物之间的差异分析从图10中可以看出每种花粉都有独特的挥发性有机物，例如黄花蒿中的2-hexenol和methylhexanoate等物质(图10上半部分第一个框)；dzh中的2-pentanone等物质(图10上半部分第二个框)，sh中的1-pentanol等物质(图10上半部分第三个框)。图9-10中每一行代表一个花粉样品中选取的全部信号峰；图9-10中每一列代表同一挥发性有机物在不同花粉样品中的信号峰；从图9-10中可以看出每种样品的完整挥发物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。实施例5不同花粉样品之间的相似度比较galleryplot插件不仅可以用于进行大量样品之间的差异分析，同时也可以给出不同样品之间的相似度差异，如下表所示：表1：四种秋季花粉之间的相似度比较：tun-1tun-2hao-1hao-2df-1df-2lv-1lv-2sample_id10092676962625552tun-192100646558595350tun-267641009678786259hao-169659610078776259hao-262587878100966664df-162597877961006664df-2555362626666100961v-1525059596464961001v-2表2：三种蒿属花粉之间的相似度比较：hhh-1hhh-2dzh-1dzh-2sh-1sh-2sample_id1009659605150hhh-19610061635251hhh-25961100925352dzh-16063921005352dzh-25152535310094sh-15051525294100sh-2实施例6不同花粉挥发性有机物的定性分析根据花粉气相保留指数的不同以及离子迁移时间的不同，并结合相应数据库，对花粉挥发性有机物进行定性分析。通过nist气相保留指数数据库及ims数据库进行二维定性，更加准确与快捷，结果如下表3-表6所示：表3四种花粉中挥发性有机物的定性分析表4黄花蒿有机物定性分析表5大籽蒿花粉挥发性有机物定性分析结果表6沙蒿花粉挥发性有机物定性分析结果实施例7不同花粉挥发性有机物的相对定量分析和比较分析根据各种挥发性有机物的峰谱图和峰面积，可分析比较出不同花粉挥发性有机物的相对含量。1.对四种秋季花粉挥发性有机物分析结果如下：a.四种花粉的挥发性有机物差异很大，豚草花粉有独特的挥发性有机物cyclohexanone(环己酮)，地肤花粉中也含有独特的挥发性有机物1-pentanol(正戊醇)，2-heptanone(2-庚酮)；b.四种花粉的共性挥发性有机物包括ethanol(乙醇)、ethylmethylketone(丁酮)、dimethylketone(丙酮)、dimethylsulfide(二甲基硫醚)等，且其在四种花粉中含量相近；c.葎草花粉中allylmethylsulfide(烯丙基甲基硫醚)相对含量高于地肤和大籽蒿；豚草花粉中极低；d.3-methylthiopropanal(3-甲硫基丙醛)在葎草花粉中相对含量高于地肤和大籽蒿；豚草花粉中极低；e.benzaldehyde(苯甲醛)在葎草、大籽蒿和豚草中含量相近，均高于地肤花粉中的相对含量；f.地肤花粉中2-heptanone(2-庚酮)的相对含量高于葎草、大籽蒿和豚草花粉；g.methylhexanoate(己酸甲酯)在大籽蒿花粉中相对含量最高，在地肤花粉中相对含量仅次于大籽蒿；h.1-hexanol(正己醇)在地肤中相对含量最高，在大籽蒿花粉中相对含量较低；i.1-propanol(正丙醇)在大籽蒿、葎草以及地肤花粉中含量接近，但在豚草中含量相对较低；g.2-methylpropanol(2-甲基丙醇)在葎草中含量最高，在地肤和大籽蒿花粉含量相对较低；k.ethylmethylketone(甲基乙基酮)在葎草、地肤和大籽蒿花粉中含量接近；l.pentan-2,3-dione(2，3-戊二酮)在大籽蒿、葎草以及地肤花粉中含量接近；m.2-pronanol(2-丙醇)在大籽蒿中含量最高，地肤花粉仅次于其次，豚草和葎草花粉中相对含量最低；n.ethylacetate(乙酸乙酯)在大籽蒿花粉中含量最高，地肤和豚草花粉仅次于其次，葎草花粉中含量相对较低；o.3-methylbutana(3-甲基丁醛)在豚草花粉中含量最高，在大籽蒿花粉中相对含量仅次于其，在豚草花粉中含量最低；p.花粉有机挥发物中，还包含许多有机挥发物气体的二聚体形式，豚草花粉有独特的挥发性有机物cyclohexanone；地肤花粉中也含有独特的挥发性有机物1-pentanol二聚体；pentan-2,3-dione二聚体在大籽蒿、葎草以及地肤花粉中含量接近；ethylacetate二聚体在大籽蒿花粉中含量最高，地肤和豚草花粉仅次于其次；3-methylbutanal二聚体在豚草花粉中含量最高，在大籽蒿花粉中相对含量仅次于其，在豚草花粉中含量最低；2-methylpropanol在葎草中含量最高，在地肤和大籽蒿花粉含量相对较低；ethanol、ethylmethylketone二聚体在四种花粉中含量相近。2.对三种蒿属花粉挥发性有机物分析结果如下：a.黄花蒿花粉中含有独特的挥发性有机物methylhexanoate(己酸甲酯)、2-hexenol(2-己烯醇)；大籽蒿中也有独特的挥发性有机物methylsulfide(二甲硫醚)；沙蒿中的独特的挥发性有机物包括1-pentanol(正戊醇)、benzaldehyde(苯甲醛)以及dimethyldisulfide(二甲基二硫醚)；b.ethylpentanoate(戊酸乙酯)、acetone(丙酮)、1-propanol(正丙醇)、alpha-pinene(α-蒎烯)、以及ethanol(乙醇)以及ethylmethylketone(甲基乙基酮)在大籽蒿、沙蒿和黄花蒿中共有，且含量相当；c.2-hexenol(2-己烯醇)、2-methylpropanal(2-甲基丙醛)二聚体在黄花蒿中含量最高，在沙蒿和大籽蒿中含量较低；d.2-pentanone(2-戊酮)二聚体、1-butanol(正丁醇)二聚体以及1-propanol(正丙醇)二聚体在大籽蒿中含量最高，在沙蒿和黄花蒿中含量较低；e.1-pentanol(正戊醇)二聚体、2-heptanone(2-庚酮)二聚体以及ethylmethylketone(甲基乙基酮)二聚体在沙蒿中含量最高，在大籽蒿和黄花蒿中较低；f.pentanal(正戊醛)二聚体在黄花蒿中含量最高，在沙蒿中含量与黄花蒿相近，但并不存在于大籽蒿中；g.ethylacetate(乙酸乙酯)二聚体在黄花蒿中含量最高，在沙蒿中含量较低，在大籽蒿中的含量低于沙蒿；h.butylacetate(乙酸丁酯)二聚体在沙蒿中含量最高，在黄花蒿中含量较低，在大籽蒿中不存在；i.hexanal(正己醛)二聚体在大籽蒿、沙蒿和黄花蒿中共存，但在沙蒿中含量相对较低；j.ethanol(乙醇)二聚体在大籽蒿和沙蒿中含量较高，在黄花蒿中含量相对较低；k.1-hexanol(正己醇)、1-butanol(正丁醇)、hexanal(正己醛)在黄花蒿和沙蒿中含量较高，在大籽蒿中相对较低；l.2-pentanone(2-戊酮)、ethylhexanoate(己酸乙酯)在大籽蒿中含量最高，在沙蒿和黄花蒿中含量极低；m.heptanal(正庚醛)、alpha-pinene(α-蒎烯)在沙蒿中含量最高，在大籽蒿和黄花蒿中含量较低；n.pentanal(正戊醛)、2-methylpropanal(2-甲基丙醛)在黄花蒿中含量最高，在沙蒿和大籽蒿中含量相对较低；o.ethylacetate(乙酸乙酯)在沙蒿中含量最高，在黄花蒿中含量较低，在大籽蒿中几乎不存在；p.butylacetate(乙酸丁酯)在沙蒿和黄花蒿中含量很高，在大籽蒿中几乎不存在；q.butylmethylketone(甲基丁基酮)在沙蒿和大籽蒿中含量较高，在黄花蒿中含量较低。实施例8对不同花粉样品分类以及快速确定未知样品的种类为了更加直观区分不同样品，使用pca，四种秋季花粉的主成分分析结果如图15所示。由图15可以看出，四种花粉的差异很大，各自在一个位置上，如果有未知花粉，很容易区分是哪种类型。当前第1页12