一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒的制作方法

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域,特别涉及一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒。

背景技术

人纤维蛋白溶酶原是人纤维蛋白溶酶的前体物质,没有活性。在正常人体内,人纤维蛋白溶酶原通过纤维蛋白溶酶原激活因子激活转变成有活性的人纤维蛋白溶酶。人纤维蛋白溶酶原(plasminogen,pg)是1种血浆蛋白,主要由肝细胞产生,血浆中的含量为0.06-0.25mg/ml。该蛋白能够被纤维蛋白溶酶原激活因子激活,转变成有活性的纤维蛋白溶酶后发挥各种生理作用。

纤维蛋白溶酶原是纤溶酶的前体形式,由激活物激活,进而水解纤维蛋白(原)和其它的凝血因子,起到抗凝的作用。纤溶酶的作用是保持血管内的凝血、纤溶的平衡,使血流畅通。纤维蛋白溶酶原主要生理功能是参与纤溶系统。纤维蛋白溶酶原在血清中处于非活性状态,可被尿激酶、链激酶、胰蛋白酶、凝血酶等物质激活。激活后的纤维蛋白溶酶原转变为纤溶酶,它可以水解凝固的纤维蛋白,从而使得沉淀附着于血管壁的纤维蛋白得以逐渐溶解,起到抗凝的作用。严重创伤、灼伤、外科手术、产科意外、输血反应等病理情况时,纤溶系统被过度激活,致使大量的纤维蛋白溶酶原转变为纤溶酶,其活力过强,超过了抗纤溶酶的抑制能力,这时就会导致纤溶过度而致出血。纤溶过度也是血管内弥散性凝血的重要特征。

对纤维蛋白溶酶原的检测主要是免疫比浊法,但是该方法用到抗体,所以普通的纤维蛋白免疫比浊法检测试剂稳定性不好,准确度和灵敏度也不高,因而限制了其在临床上的推广应用。

技术实现要素：

本发明在抗原-抗体特异性结合法的基础上,优化反应体系,通过使用羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒和海藻糖,显著改善了试剂的准确度、分析灵敏度和稳定性等,是一种更加稳定、抗干扰能力强的纤维蛋白溶酶原检测试剂。

本发明是通过以下措施实现的：

一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,其特征在于,它包含试剂r1、试剂r2和校准品,其中试剂r1组成为：100mmol/lph7.6mes缓冲液、25ml/ltritonx-100、28g/l海藻糖；试剂r2组成为：100mmol/lph7.6mes缓冲液、30ml/l羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒、7.7mmol/l叠氮钠。

所述试剂r1和试剂r2在使用时的比例为r1：r2＝225：75。

本发明所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的pg校准品。

本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪东芝120上进行,其具体使用方法见图4。

加入生理盐水、样本或校准品3μl,之后再加入r1试剂225μl预孵育5min后读取吸光度a1,之后再加入75μl的试剂r2反应5min后,读取吸光度a2,并计算δa。

本发明的有益效果：

本发明提供的纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,通过在试剂r1中加入海藻糖,使反应体系更加粘稠,且相对地中性,在一定程度上解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题,从而对抗体起到一定的保护作用；同时在试剂r2中加入羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒而不是羊抗人pg抗体,从而在根源上对抗体起到了一定保护作用。因此,海藻糖与胶乳颗粒共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性,却不会对试剂的准确度产生影响,有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图4为试剂盒在全自动生化分析仪上的具体使用方法。

具体实施方式

为了更好的理解本发明,下面结合具体实施例来进一步详细说明。

实施例1

一种常规的纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

tritonx-10025ml/l

试剂r2组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

羊抗人pg抗体30ml/l

叠氮钠7.7mmol/l

本实施例描述的试剂盒,在使用时,其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪,操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品3μl,之后再加入r1试剂225μl预孵育5min后读取吸光度a1,之后再加入75μl的试剂r2反应5min后,读取吸光度a2,并计算δa。

本实施例所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的pg校准品。

实施例2

一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

tritonx-10025ml/l

海藻糖10g/l

试剂r2组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒30ml/l

叠氮钠7.7mmol/l

具体测定方法同实施例1。

实施例3

一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

tritonx-10025ml/l

海藻糖20g/l

试剂r2组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒30ml/l

叠氮钠7.7mmol/l

具体测定方法同实施例1。

实施例4

一种纤维蛋白溶酶原免疫比浊法检测试剂盒,它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

tritonx-10025ml/l

海藻糖28g/l

试剂r2组成为：

ph7.6mes缓冲液100mmol/l

羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒30ml/l

叠氮钠7.7mmol/l

具体测定方法同实施例1。

对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。

准确度验证实验：

将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组,市场上获得认可的一种准确度优异的纤维蛋白溶酶原试剂盒(上海某公司生产)作为对照组进行对比实验,对40个样本进行检测,检测的结果如图1-图3。

通过图1-图3的检测数据可知,实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9941、0.9981、0.9998,相关性比较好,表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的纤维蛋白溶酶原检测试剂盒有高度一致性,证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响,试剂盒依然保持较好的准确度。

线性相关性验证实验：

找到纤维蛋白溶酶原高值样本为420.0mg/l,用生理盐水进行系列稀释,配制6个不同浓度的样本,依次为420.0mg/l、336.0mg/l、252.0mg/l、168.0mg/l、84.0mg/l、0.0mg/l浓度的样本,每个浓度水平各样本分别测定三次,分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表1所示。

表1实施例1-4线性相关验证实验检测结果

上述检测结果显示,实施例1-4检测结果相关性均大于0.990,但实施例2、3、4的检测结果不小于0.999,与实施例1相比具有更好的线性相关性,这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂,检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次,取平均值,与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比,从而确定试剂的稳定时间。检测数据如表2。

表2稳定性验证实验检测结果

实验结果显示,实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定,而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定,说明在试剂中加入海藻糖和胶乳颗粒,二者共同作用有效的提高了纤维蛋白溶酶原检测试剂盒的稳定性。

分析灵敏度验证实验：

用本发明纤维蛋白溶酶原试剂盒测试已知浓度在285.4mg/l的样本,记录吸光度差值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表3所示。

表3分析灵敏度实验结果

通过检测数据可知,实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高,说明通过在试剂r1中加入海藻糖,使反应体系更加粘稠；同时在试剂r2中加入羊抗人pg抗体包被胶乳颗粒,反应后更容易形成沉淀,扩大了响应信号,大大的提高了试剂的分析灵敏度。

综合以上分析,本发明提供的纤维蛋白原免疫比浊法检测试剂盒,在试剂r1中通过加入一定量的海藻糖和在试剂r2中加入一定量的胶乳颗粒能够有效的提高试剂盒的稳定性和分析灵敏度,线性范围较好,试剂的准确度也较好。因此,本发明提供的纤维蛋白原免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。