灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱及其构建方法和应用与流程

本发明涉及特征图谱及其构建方法和应用，尤其涉及灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱及其构建方法和应用。
背景技术：
：灵芝(Ganodermalucidum)，是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的食药用真菌。《神农本草经》中记载“赤芝，味苦、平，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘。”《本草纲目》中同样记载，灵芝“甘温无毒，主治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，疗虚劳，治痔”，用药历史达2000多年，是我国传统的珍贵药材。灵芝含有三萜、多糖、甾醇、蛋白质和多种挥发性成分等，挥发性成分不仅决定了灵芝的特征性气味，其中部分挥发性成分还具有一定的保健功能，已成为评价灵芝品质优劣的重要指标之一。目前，对于灵芝化学成分的研究主要集中在三萜和多糖方面，而对其挥发性成分的研究相对较少。技术实现要素：针对以上不足，本发明提供一种灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱及其构建方法和利用特征图谱进行灵芝防伪和品质鉴定的应用。第一方面，本发明公开了灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱，如图2所示。第二方面，提供一种上述灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的构建方法，包括：(1)样品前处理：取灵芝子实体样品用粉碎机粉碎，混匀，装入固相微萃取专用顶空瓶；(2)顶空固相微萃取：将装有样品的顶空瓶在60～70℃预平衡40～60min，将老化后的萃取头插入到样品瓶顶空部分吸附30～45min；(3)灵芝GC-MS特征图谱的采集：将已吸附好的萃取头用GC-MS仪器分析，插入GC-MS进样口解析5～8min；进行色谱和质谱分析；(4)特征图谱的构建：分别测定不同的灵芝样品，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行指纹图谱分析，匹配共有峰，生成灵芝GC-MS特征图谱。在第三方面，提供一种将上述灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的应用，用于灵芝及其相关产品的定性检测和/或相对定量分析。进一步地，在构建灵芝GC-MS特征图谱后，将待测定样品的GC-MS图谱与本发明构建的灵芝特征图谱进行进行相似度分析及主成分分析。本发明的有益效果是：通过建立灵芝的特征图谱，对共有峰进行定性分析，进而对待测灵芝或其他食用菌及其相关产品进行区分鉴别，并通过GC-MS特征图谱分析，辨识不同品种灵芝，使用方便、快捷，鉴别准确度高，这对灵芝的开发、利用和质量评价具有很高的应用价值。附图说明图1是本发明涉及的15种灵芝的挥发性成分的叠加图谱。图2是建立的灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱。图3是灵芝与其他食用菌PCA分析结果。具体实施方式特征图谱是指样品经过适当的处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到的，能够标识其中各种组分群体特征的共有峰的图谱。它是一种综合的、可量化的鉴别手段，可用于鉴别样品的真伪，评价样品质量的均一性和稳定性。本发明利用顶空固相微萃取技术将挥发性成分萃取到固相微萃取的纤维上，同时实现萃取、净化、浓缩，最后结合GC-MS解析并分析，具有重复性好、高效、无需溶剂等特点，可全面准确分析灵芝挥发性成分的组成，构建其特征图谱，用于灵芝的防伪以及质量分析。第一方面，本发明公开了灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱，如图2所示。优选的，所述图谱的特征峰如表1所示。第二方面，提供一种上述灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的构建方法，包括：(1)样品前处理：取灵芝子实体样品用粉碎机粉碎，混匀，装入固相微萃取专用顶空瓶；(2)顶空固相微萃取：将装有样品的顶空瓶在60～70℃优选在60℃预平衡40～60min，将老化后的萃取头插入到样品瓶顶空部分吸附30～45min；(3)灵芝GC-MS特征图谱的采集：将已吸附好的萃取头用GC-MS仪器分析，插入GC-MS进样口解析5～8min，优选5min；进行色谱和质谱分析；(4)特征图谱的构建：分别测定不同的灵芝样品，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行指纹图谱分析，匹配共有峰，生成灵芝GC-MS特征图谱。优选的，所述步骤(1)中粉碎机粉碎后过50～80目筛。优选的，所述步骤(1)中顶空瓶为20mL，进样量为1g。优选的，一种上述灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的构建方法，包括：(1)样品前处理：取不同灵芝子实体样品用粉碎机粉碎，过50～80目筛，混匀，采用四份法精准称取1g，装入20mL固相微萃取专用顶空瓶；(2)顶空固相微萃取：将装有样品的顶空瓶在60～70℃预平衡40～60min，将老化后的萃取头插入到样品瓶顶空部分吸附30～45min；(3)灵芝GC-MS特征图谱的采集：将已吸附的萃取头用GC-MS仪器分析，插入GC-MS进样口解析5～8min，进行色谱和质谱分析；(4)特征图谱的构建：测定不同的灵芝样品，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行指纹图谱分析，匹配共有峰，生成灵芝GC-MS特征图谱，并进行相似度分析。优选的，所述步骤(3)中的色谱条件：HP-5DM色谱柱；升温程序：40℃保持3min，以5℃/min上升至80℃，保持3min，再以10℃/min上升至220℃，保持2min，最后以5℃/min上升至240℃，保持2min；进样口温度：260℃；进样模式：不分流；载气：氦气；流速：1mL/min；质谱条件：离子源温度：230℃；接口温度：250℃；四级杆温度：150℃；电离方式：电子轰击离子源EI+，电子能量70eV；扫描质量范围：35-450amu。优选的，所述的步骤(3)中HP-5DM色谱柱采用30m×0.25mm×0.25μm。优选的，所述步骤(1)中采用灵芝子实体样品为15种不同的灵芝子实体样品，命名为图1的S1-S15。优选的，所述的步骤(4)中以S1的色谱图为参照图谱，采用中位数法，设定时间窗宽度为0.4，进行多点校正，生成灵芝GC-MS特征图谱。在第三方面，提供一种将上述灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的应用，用于灵芝及其相关产品的定性检测和/或相对定量分析。具体地，上述定性检测和/或相对定量分析包括：将待检测样品采用上述构建方法进行HS-SPME/GC-MS图谱构建，与灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱(图2)比较，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)进行自动匹配生成共有峰，根据其保留时间进行定性分析，和/或通过峰面积归一化法进行相对定量分析。优选的，在构建灵芝GC-MS特征图谱后，将待测定样品的GC-MS图谱与本发明构建的灵芝特征图谱进行相似度评价及主成分分析。进一步优选的，所述相似度分析及主成分分析包括：将灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱(图2)与待检测样品的GC-MS图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统检验版(2004B版)，自动匹配，得到相同保留时间对应的峰面积，导入到SIMCA软件中分析，进行主成分分析(PCA分析)。在上述相似度分析中，相似度数值越高表示成分的种类和数量越接近。进一步地，发明人认为，由于挥发性成分是一个复杂的体系、受菌种、栽培条件、气候环境等因素影响，相似度分析不能单独用于灵芝样品的防伪和检测，结合主成分分析分析结果来说明灵芝样品的防伪和检测更加准确可靠。如在实施例2的PCA分析图中，15种灵芝聚集成一簇，其他食用菌(假芝、香菇和草菇)与之分散，表示其他食用菌与灵芝有明显差异。本发明公开了灵芝挥发性成分HS-SPME/GC-MS特征图谱及其构建方法及其应用，能较好地分析灵芝挥发性物质的组成，为灵芝挥发性成分分析提供了新方法，并能准确地反映灵芝的整体质量特征，通过色谱指纹特征相似程度的比较，对其进行质量控制和防伪，对灵芝的研究及进一步开发有推动作用。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。实施例1灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的构建采自安徽(S1～S4)、福建(S5～S6)、山东(S7～S9)、浙江(S10～S12)和陕西(S13～S15)等不同灵芝主产区的赤芝样品。PDMS/DVB/CAR(50/30μm)萃取头(上海安谱实验科技股份有限公司)；7890A-5975C气相色谱－质谱联用仪(美国安捷伦公司)。方法：1、取各种样品适量，切成小块后，用粉碎机将样品粉碎，过50～80目筛，采用四份法取样1.00g，装入20mL固相微萃取专用顶空瓶，待检测。2、取样前先将固相微萃取头在气相色谱进样口250℃老化2h，进样口采用不分流模式，载气为He，流量1.0mL/min。取装有样品的顶空瓶在60℃电热恒温水浴锅中预平衡40min，将固相微萃取器的萃取头通过聚四氟乙烯隔垫插入到样品瓶顶空部分，萃取30min，萃取温度为60℃，然后将萃取头抽出，插入GC-MS进样口，于250℃解吸5min，用气相色谱-质谱联用仪测定。3、气相色谱-质谱条件色谱条件：色谱条件：HP-5DM(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；升温程序：40℃保持3min，以5℃/min上升至80℃，保持3min，再以10℃/min上升至220℃，保持2min，最后以5℃/min上升至240℃，保持2min；进样口温度：260℃；进样模式：不分流；载气：氦气；流速：1mL/min。质谱条件：离子源温度：230℃；接口温度：250℃；四级杆温度：150℃；电离方式：电子轰击离子源EI+，电子能量70eV；扫描质量范围：35-450amu。4、数据分析采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价相似度，SIMCA软件进行主成分分析(PCA)。5、灵芝挥发性成分HS-SPME/GC-MS特征图谱的构建分别测定不同的灵芝样品，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)进行指纹图谱分析，以S1的色谱图为参照图谱，采用中位数法，设定时间窗宽度为0.4，进行多点校正，生成15种灵芝样品GC-MS叠加图谱，见图1，以及生成特征图谱R，见图2。其中，挥发性成分特征图谱的特征峰见表1。并，进行相似度评价分析，见表2。表1灵芝挥发性成分特征图谱的特征峰注：色谱峰编号，分别代表在GC-MS分析中共有峰成分。表215种灵芝GC-MS特征图谱与特征图谱R的相似度S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15R0.9530.8650.8650.8580.9560.8450.8890.9330.9590.9890.9250.9520.9670.9590.939从表2的相似度分析可以看出，15个样品共有峰与特征图谱信息相似性较好，所构建的挥发性成分特征图谱信息具有可靠性和重复性。实施例2灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱的应用灵芝挥发性成分的HS-SPME/GC-MS特征图谱可区分灵芝与其他蘑菇(假芝、香菇和草菇)利用实施例1中的HS-SPME/GC-MS的图谱构建方法分别对假芝、香菇和草菇进行上述步骤的提取分析，得到对应的GC-MS图谱，再将这3个色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统检验版(2004B版)，计算这3个样品的图谱与图2的特征图谱R的相似度，样品图谱相似度分析结果分别为：0.706，0.378和0.583，相似度较低。采用SIMCA软件分别对3种其他食用菌(假芝、香菇和草菇)和15个品种灵芝进行主成分分析，结果见图3。从图3可以看出，15种灵芝聚集成一簇，其他三种食用菌分散在不同位置，说明他们存在明显差异，表明本实验方法具有可靠性。以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3