一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法与流程

本发明涉及一种免疫荧光染色方法，尤其涉及一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性染色方法。

背景技术：

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。免疫荧光技术主要包括直接染色法、间接法和抗补色染色法。

直接染色法的操作流程为：将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经过一定温度和时间的染色，洗去未产假反应的多余光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。其优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照,抑制试验对照。

间接染色法用于检查未知抗原，其操作流程为：先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗傣用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血滴)。

抗补色染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体复合物，发出荧光。抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原抗体系统。因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。

除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体抗补体法等。

如专利号为201410659745.9，专利名为一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置，本发明公开了一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置。具体地，本发明公开了一种单个循环肿瘤细胞的分离方法，先对外周血样本进行阴性富集，获得富集的ctc细胞样本；分别使用第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二荧光标记的抗cd45抗体对富集的ctc细胞样本进行荧光染色，并对染色后的ctc细胞样本进行稀释；对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。该方法为抗补体染色法，对表达抗原的细胞，如白细胞，进行荧光染色，而ctc细胞即为不表达抗原的细胞，该方法操作步骤复杂，在细胞样本量大的情况下，其鉴别分离难度大，无法快速操作，因为在ctc细胞检测过程中，白细胞的数量为几万甚至几十万，而ctc细胞则只有3、4个，因此使用现有的荧光染色方法识别分离过程麻烦，读片容易产生差错。因此，发明人发明了一种识别细胞群中不表达某一抗原的方法，可对不表达抗原的细胞进行染色，与现有的免疫荧光技术是互补的染色方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，容错率低，可快速识别不表达抗原的细胞免疫阴性荧光染色方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，所述方法至少包括：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。

为了使所有细胞均能染色，所述荧光剂包括细胞核荧光剂和细胞蛋白胺基荧光剂。

优选地，所述荧光剂为所述细胞核荧光剂时，所述方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，2)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，3)荧光淬灭剂洗脱，4)荧光显微镜观察；

或所述方法包括以下步骤：1)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，2)荧光淬灭剂洗脱，3)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，4)荧光显微镜观察。

优选地，所述细胞核荧光剂为dapi。

优选地，所述荧光剂为所述细胞蛋白胺基荧光剂时，所述免疫阴性荧光染色方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞蛋白胺基进行无差别荧光染色，2)荧光剂洗脱，3)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，4)荧光淬灭剂洗脱，5)荧光显微镜观察。

优选地，所述抗体为egfr抗体或cd45抗体。

优选地，所述抗体与所述荧光淬灭剂按照质量比以1:0.01进行配比。

优选地，所述荧光淬灭剂标记的抗体的制备方法包括：1)配制0—4℃1mg/ml抗体溶液备用；2)根据所述抗体抗体与荧光淬灭剂的质量比为1:0.01，称取所述荧光淬灭剂，配制成0.01mg/ml的荧光淬灭剂溶液；3)将所述抗体溶液与荧光淬灭剂溶液按照体积比1:1混合，充分搅拌后，在0—4℃冰箱中静置；4)所述荧光淬灭剂溶液与抗体溶液结合完毕后，将该溶液离心过滤，将上清液装入透析袋中透析；5)取上述透析袋内的溶液，加入缓冲液混合均匀后形成荧光淬灭剂-抗体溶液。

为了去除多余的未反应的荧光淬灭剂，所述步骤5)中的缓冲液为伯胺类缓冲液。

优选地，所述方法包括以下步骤：1)将实验细胞进行离心，用1×pbs缓冲液吹悬，涂敷在载玻片上，并烘干；2)将烘干后的细胞载玻片，使用所述荧光淬灭剂标记的抗体覆盖细胞涂片区，进行抗体孵育；3)使用pbst缓冲液洗脱；4)使用所述细胞核荧光剂dapi覆盖细胞涂片区，并盖上盖玻片；5)荧光显微镜进行观察。

与现有技术相比，本发明的优点在于：快速识别细胞群中不表达某一抗原的方法，可对不表达某一抗原的细胞，如u87细胞、ctc细胞等，进行染色，操作简单，实验步骤少，容错率低，节省大量人力，便于后续细胞分离及读片。

附图说明

图1为tidequencher1(荧光淬灭剂)的淬灭波长示意图、

图2为实验组a组10x细胞染色示意图。

图3为实验组b组10x细胞染色示意图。

图4为实验组c组10x细胞染色示意图。

图5为实验组d组10x细胞染色示意图。

图6为对照组e组40x细胞dapi染色示意图。

图7为对照组e组40x细胞fitc染色示意图。

图8为图6和图7的合成图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明的一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，是一种识别细胞群中不表达某一抗原的方法，其包括至少两个步骤：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。其中，荧光剂标记细胞细胞核或蛋白质胺基，确保全部细胞均能被染色，荧光淬灭剂使表达抗原的细胞被抗体标记；表达抗原的细胞的荧光基团被荧光淬灭剂淬灭，而无法发出荧光，不表达抗原的细胞因未被抗体标记，在荧光显微镜下可观察到荧光。该方法可快速识别不表达抗原的细胞，便于后续细胞的分离和读片，操作简单，容错率低。需要注意的是，本发明中所述的不表达抗原的细胞是指不表达某一抗原的细胞，该抗原是根据实验要求确定，并不作具体要求。

本发明一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法的操作步骤包括：(1)使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色，(2)荧光剂洗脱，(3)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，(4)荧光淬灭剂洗脱，(5)荧光显微镜观察。荧光剂可选择fitc、tritc、dapi、reddot1等细胞蛋白胺基荧光剂或细胞核荧光剂，其中优选为dapi、reddot1等本身不发出荧光或荧光较弱的细胞核荧光剂，该类荧光剂无需洗脱，从而减少洗脱次数，使实验结果更加明显准确。另外，因dapi、reddot1等细胞核荧光剂本身不发出荧光或荧光较弱，无需洗脱，实验过程中也可先使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行染色，再使用细胞核荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，不对实验结果产生影响；其操作步骤包括：(1)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，(2)荧光淬灭剂洗脱，(3)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，(4)荧光显微镜观察。

本方法适合于抗原阴性细胞和抗原阳性细胞数量相差巨大的场景中，如细胞种类鉴定，细胞分离、ctc细胞(循环肿瘤细胞)检测等。以鉴定u87细胞(人神经胶质瘤细胞)和h1975细胞(人肺腺癌细胞)为例，其中h1975细胞表达egfr(表皮生长因子受体)，u87细胞不表达egfr。

实验组

1、荧光淬灭剂标记抗体

1.1使用pbs缓冲液，配制0—4℃1mg/ml抗体溶液备用。其中避免使用含有伯胺的缓冲液，如tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，伯胺类物质可与荧光淬灭剂反应，生成与抗体竞争结合的化合物，使抗体标记失败。本实验组的抗体为egfr抗体。

1.2按每毫克egfr抗体中加0.01mg荧光淬灭剂染料计算，称取所需的荧光淬灭剂染料，用dmf(二甲基甲酰胺)缓冲液溶解，配制成0.01mg/ml的荧光淬灭剂溶液。为了使荧光淬灭效果最佳，其配合荧光剂的发光波长，其荧光淬灭剂的淬灭波长为250nm—600nm之间，其优选的淬灭波长为350nm—530nm，优选的荧光淬灭剂为tidequencher1(马来酰亚胺)，如图1所示的tidequencher1的淬灭波长示意图，其最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。

1.3将上述已准备好的egfr抗体溶液与tidequencher1溶液按照体积比1:1混合，充分搅拌后，在0—4℃冰箱中静置18—24h，使其完全结合。

1.4tidequencher1溶液与egfr抗体溶液结合完毕后，将该溶液以2500r/min离心20min，过滤沉淀物后，将上清液装入透析袋中再置于烧杯中，在0—4℃下用ph8.0的pbs溶液透析过夜。

1.5取上述透析袋内的溶液，加入等体积的浓度为500mmol/ltris缓冲液，其ph为8.0混合均匀后形成tidequencher1-抗体溶液，置于0—4℃下保存。其中，因tris缓冲液为伯胺类缓冲液，可与剩余的未与抗体结合的tidequencher1反应，去除多余的tidequencher1，避免抗体孵育时多余的tidequencher1与细胞表面蛋白反应，干扰实验结果。

2免疫阴性荧光染色

2.1准备实验用实验细胞h1975细胞和u87细胞，分别在显微镜下计数，计算各自的细胞密度。

2.2根据计算出的细胞密度，取u87细胞与h1975细胞相应体积的细胞溶液，使溶液里的细胞均为10⁷个，500g离心10分钟，除去上清液，用1ml1×pbs缓冲液吹悬，稀释至10⁷个/ml，分别作为a组与b组。

2.3分别取上述a组和b组的u87细胞与h1975细胞，按照细胞数量将两种细胞进行混合，配置两种不同比例的混合组，其配制比例为u87：h1975＝1：10⁴，1：10⁵，并作为c组和d组。

2.4将上述c、d两组细胞均稀释至10⁷个/ml。

2.5分别取上述a、b、c、d四组细胞500g进行离心，用0.4％多聚甲醛1×pbs缓冲液吹悬，涂敷在载玻片上，并在65℃烘干1小时。

2.6将上述烘干后的a、b、c、d四组载玻片，分别取上述配制的tidequencher1-抗体溶液100ul覆盖细胞涂片区，并放在37℃孵育1小时。

2.7pbst中清洗两次，每次3分钟。

2.8加10uldapi荧光剂覆盖细胞涂片区，盖上盖玻片。淬灭

上述2.6-2.8步骤均需在避光条件下操作。

2.9将处理完成后的a、b、c、d四组细胞图片置于10x的荧光显微镜中进行观察，其结果如图2-5所示。

对照组

1、荧光剂标记抗体

1.1使用pbs缓冲液，配制0—4℃1mg/mlegfr抗体溶液备用。同样的，应避免使用含有伯胺的缓冲液。

1.2按每毫克egfr抗体中加0.01mgfitc(荧光剂)染料计算，称取所需的fitc染料，用dmf缓冲液溶解，配制成0.01mg/ml的fitc溶液。

1.3将上述已准备好的egfr抗体溶液与fitc溶液按照体积比1:1混合，充分搅拌后，在0—4℃冰箱中静置18—24h，使其完全结合。

1.4fitc溶液与egfr抗体溶液结合完毕后，将该溶液以2500r/min离心20min，过滤沉淀物后，将上清液装入透析袋中再置于烧杯中，在0—4℃下用ph8.0的pbs溶液透析过夜。

1.5取上述透析袋内的溶液，加入等体积的浓度为500mmol/ltris缓冲液，其ph为8.0混合均匀后形成fitc-抗体溶液，置于0—4℃下保存。

2免疫阳性荧光染色

2.1分别取实验组a组和b组的u87细胞与h1975细胞，按照u87：h1975＝1:100的细胞数量比例混合均匀，以此作为对照组e组。

2.2将上述e组细胞稀释至10⁷个/ml。

2.3取上述e组细胞500g进行离心，用0.4％多聚甲醛1×pbs缓冲液吹悬，涂敷在载玻片上，并在65℃烘干1小时。

2.4取10uldapi荧光剂覆盖载玻片细胞涂片区，盖上盖玻片。将该载玻片置于40x的荧光显微镜中进行观察，其结果如图6所示。

2.5取上述配制的fitc-抗体溶液100ul覆盖载玻片细胞涂片区，并放在37℃孵育1小时后；使用pbst中清洗两次，每次3分钟，清洗后将该载玻片置于40x的荧光显微镜中进行观察，其结果如图7所示。

上述2.4-2.5步骤均需在避光条件下操作，除荧光显微镜观察细胞玻片。

2.6将得到的图6和图7进行重叠合成，其结果如图8所示。

本对照组为直接染色法，其中dapi荧光剂为第一荧光剂，fitc荧光剂为第二荧光剂；u87细胞只能被dapi染色，h1975细胞可以被dapi与fitc同时染色。

3结果分析

如图6-8为对照组免疫阳性荧光染色的细胞染色结果。其中图6显示细胞dapi染色结果为阳性，包括u87细胞和h1975细胞，图7显示细胞fitc染色结果为阳性，为h1975细胞。合成图图8显示，图7显示的h1975细胞与图6显示的部分细胞重合，因此可知，未重合的细胞为u87细胞。因此，直接染色法无法直接识别出不表达egfr的u87细胞，还需要排除fitc染色后，才能判定细胞是否为u87细胞。

如图2-5为本发明的实验组阴性荧光染色的细胞染色结果。其中图2为a组的u87细胞染色图，显示u87细胞的染色结果为阳性，dapi荧光剂未被淬灭。图3为b组h1975细胞染色图，显示h1975细胞的荧光发生了淬灭，其染色结果为阴性。图4和图5分别是以1:10⁴比例混合的c组和以1:10⁵比例混合的d组的细胞染色图，结合图2和图3可知，c组中检测出7个u87细胞，d组检测出1个u87细胞，结果清晰明了。

另外，实验组的各组h1975细胞细胞浓度均远远高于对照组，实验组的细胞染色图的放大倍数为10x，而对照组的细胞染色图的放大倍数为40x，由此可知，在实际观察中，实验组的h1975细胞细胞数量远远大于对照组，其识别难度更高，但是对比图4、图5和图8的结果，可以看出，图4，图5更加简洁明了，由此也可证明本发明的免疫阴性荧光方法的在识别细胞上的快速性，并且非常适用于样本量大或抗原阴性细胞和抗原阳性细胞的数量差距大的情况，操作简单，经济快速，大大节省了人力、物力、财力。

另外，本发明的免疫阴性荧光方法还可用于ctc细胞检测。ctc细胞样本包括正常白细胞和ctc细胞，其中正常白细胞可表达cd45，ctc细胞则不表达cd45，因此，只需将实验组中的egfr抗体更换为cd45抗体，即可快速识别ctc细胞，用于ctc检测。

本发明还可根据所需识别的细胞种类，更换其抗体，从而完成不同细胞的鉴定工作，并且也使得其后续细胞的读片及分离降低了难度，节省成本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。