基酸的胞外结构域（ECD) 组成（Pennica，D等（1984)Nature 312:724)。在EO)内，人TNFa与恒河猴的氨基酸序 列有97%相同，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠 TNFa的氨基酸序列有71% -92%相 同。可用标准的重组表达方法制备或购买其商品（R&D系统（R&DSystems)公司，产品分类 号210-TA，明尼苏达州明尼阿波利斯）。
[0133] 在某些实施方式中，"TNF a "是一种"抗原"，是能被抗-TNF a抗体结合的一种分 子或该分子的一部分。TNF-a可含有一个或一个以上的表位。在某些情况下，TNFa以高 选择性方式与抗TNF a抗体反应。优选的能结合本发明抗-TNF a抗体、片段和区域的抗原 包含SEQ ID NO: 1中的至少5个氨基酸。在某些情况下，TNF a的长度足够包含TNF a的 一个表位，从而能结合抗-TNF a抗体、其片段和区域。
[0134] 在某些实施方式中，含有结合抗-TNFa抗体、其片段和区域的长度足够的表位的 TNFa 长度至少为 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、 200、205、210、215、220个氨基酸。在一种些实施方式中，所用的TNFa包含SEQIDN0 :l的 77-233 残基。
[0135] 在某些情况下，至少标记TNF a可溶性部分，即SEQ ID NO: 1的残基77-233中的 一个氨基酸。在某些情况下，采用胺反应活性荧光团衍生物。在大多数情况下，此胺反应活 性基团是一种酰化试剂，与胺反应时能形成羧酰胺、磺酰胺或硫脲。事实上所有蛋白质都含 有赖氨酸残基，大多数的N-末端含有游离胺基，因此可用作标记物的结合位点。在一优选 实施方式中，标记残基77,所用的TNF a包含SEQ ID NO: 1的77-233残基。在另一个实施 方式中，标记许多伯胺基从而多重标记TNFa。
[0136] 在某些情况下，不标记TNFa的某一部分，即被抗体、其片段和区域识别的那部 分。换言之，TNFa抗原的某些部分可提供为抗-TNFa抗体所识别的和/或与抗-TNFa抗 体、其片段和可变区结合的拓扑结构（topographical)表位或三维表位。优选这些部分游 离而用于结合，因此不被标记。其包含SEQ ID NO: 1的136-157和164-185残基：
[0137] Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Le u-Thr-His-Thr-Ile(SEQ ID NO:2):和
[0138] Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Gl U-Thr-Pro-Glu-Glv(SEQ ID N0:3)〇
[0139] 可利用各种可检测的基团标记抗-TNFa药物。TNFa或抗-TNFa药物优选用荧 光团或荧光染料标记。适合用于本发明的示例荧光团包括通过引用纳入本文作参考的"分 子探针目录（Molecular Probes Catalogue)"中所列的那些（参见R. Haugland的"焚光探 针和标记技术指南手册（The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)"，第 10 版，分子探针（Molecular probes)公司（2005))。此类不例的焚 光团包括但不限于：Alexa 焚光染料，如 Alexa Fluor? 350、Alexa Fluor? 405、Alexa Fluor? 430、Alexa Fluor? 488、Alexa Fluor? 514、Alexa Fluor? 532、Alexa Fluor? 546、Alexa Fluor? 555、Alexa Fluor? 568、Alexa Fluor? 594、Alexa Fluor? 610、 Alexa Fluor? 633、Alexa Fluor? 635、Alexa Fluor? 647、Alexa Fluor? 660、Alexa Fluor? 680、Alexa Fluor? 700、Alexa Fluor? 750 和 / 或 Alexa Fluor? 790,以及其 他荧光团，例如丹磺酰氯（DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺）荧光素（5-IAF)、5-异硫氰酸荧光素 (FITC)、四甲基罗丹明5-(和6_)异硫氰酸盐（TRITC)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘（丙烯 酰丹（acrylodan))、7_硝基苯基-2-恶-1，3,-重氮-4-基氧化物（NBD-Cl)、溴化乙锭、荧 光黄、5-羧基罗丹明6G氢氯化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、德克萨斯红酰氯、BODIPY ?、 萘甲叉胺磺酸酯（例如1-苯胺基萘-8-磺酸（ANS)、6-(对-二磺基甲苯基）萘-2-磺酸 (TNS)等等）、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、焚光黄-磷醋酰乙醇 胺、德克萨斯红磷酯酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷酯酰胆碱，芴基-磷 醋酰胆喊、郃花青540、1- (3-讽丙基）_4_ [ β-[2 [(二-正-丁基氨基）-6萘基]乙烯基] P比啶甜菜碱（萘基苯乙烯基）、3, 3'二丙基硫代羰花青（dipropylthiadicarbocyanine)(二 S-C3- (5) )、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基）-1-甲基吡啶（二-5-ASP)、氛基_3_碘乙酰胺、 氰基-5-正-羟基琥珀酰亚胺、氰基-7-异硫氰酸盐、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、 尼罗兰、Al酞菁、恶嗪1，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)、Hoechst 33342、Τ0Τ0、吖啶 橙、乙啡啶同质二聚体、N(乙氧基羰基甲基）-6-甲氧基喹啉铵（MQAE)、呋喃-2、钙绿、羧基 SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素、晕苯、金属-配体复合物、丨RDye? 700DX、IRDye? 700、IRDye? 800RS、IRDye? 800CW、丨RDye? 800、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DY676、DY680、DY682、 DY780和其混合物。其他合适的荧光团包括：酶-辅因子、镧系元素、绿荧光蛋白、黄荧光蛋 白、红荧光蛋白，或其突变体和衍生物。在本发明一实施方式中，这种特异性结合对的第二 成员含有附着其上的可检测基团。
[0140] 荧光团中的荧光基团通常选自所述染料目录，包括聚甲炔、酞菁、花青、夹氧杂蒽、 芴、罗丹明、香豆素、荧光黄和B0DIPY?。
[0141] 在一个实施方式中，所述荧光基团是近红外（NIR)荧光团，发射光的范围约 650-约900nm。在生物学试验中采用近红外荧光技术有益，因为它可基本上消除或减少生 物物质自身荧光产生的背景。近红外荧光技术的另一优点是激发光源产生的散射光极大地 减少，因为散射光的强度与波长四次方的倒数成正比。背景荧光低和散射光低可导致提高 信嗓比，这是高灵敏度检测所需。而且，在生物组织中近-IR区（650nm-900nm)内的光透明 窗口产生的NIR荧光，为体内成像和亚细胞检测应用（需要光透射穿过生物体组分）提供 了有价值的技术。在该实施方式的诸方面中，荧光基团宜选自：IRDye? 700DX、IRDye? 700、IRDye? 800RS、IRDye? 800CW、IRDye? 800、Alexa Fluor? 660、Alexa Fluor? 680、Alexa Fluor? 700、Alexa Fluor? 750、Alexa Fluor? 790、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、 DY680、DY682和DY780。在某些实施方式中，此种近红外基团是丨RDye? 800CW、丨RDye? 800、IRDye? 700DX、IRDye? 700 或 Dynomic DY676。
[0142] 可利用荧光团的化学反应衍生物进行荧光素的标记。常用的化学反应基团包括： 胺反应的异硫氰酸衍生物，如FITC和TRITC (荧光黄和罗丹明的衍生物）；胺反应的琥珀酰 亚胺酯，如NHS-荧光素；和巯基反应的马来酰亚胺活化的荧光素，如荧光黄-5-马来酰亚 胺，它们中的许多可商品化购得。使这些反应染料的任何一种与TNFa或抗-TNFa药物反 应，可导致在荧光团与TNFa之间或荧光团与抗-TNFa药物之间形成稳定的共价键。
[0143] 在某些情况下，进行荧光标记反应后，常常需要去除标记靶分子物质中未反应的 荧光团。这通常采用分子大小排阻层析，利用荧光团与标记的蛋白质之间分子大小不同而 实现。
[0144] 可从许多来源购得反应荧光染料。其可用不同反应基团获得以将各种功能基团 附着于靶分子。也能在标记试剂盒中得到它们，试剂盒包括进行标记反应的所有组分。在 一优选方面，采用英杰（Invitrogen)公司的Alexa Fluor? 647 C2马来酰亚胺（目录号 A-20347)〇
[0145] 可直接或间接检测抗-TNF α抗体与TNF α，或抗-药物抗体（ADA)与抗-TNF α抗 体的免疫学特异性结合。直接标记物包括荧光素或冷光标签、金属、染料、放射性核素等，使 之附着抗体。在某些情况下，用碘-125 (125I)标记TNFa或抗-TNFa抗体可用于分别检测 样品中的抗-TNF α抗体或ADA的浓度水平。在其他情况下，采用对样品中的抗-TNF α抗体 或ADA分别具有特异性的化学发光TNFa试验或抗-TNFa抗体的化学发光试验，适合于灵 敏地无放射活性地检测抗-TNF α抗体或ADA的浓度水平。在特定情况下，用荧光染料标记 TNF α或抗-TNF α抗体也适合分别检测样品中的抗-TNF α抗体或ADA的浓度水平。荧光 染料的示例包括但不限于：Alexa Fluor?染料、DAPI、荧光黄、Hoechst33258、R-藻青蛋白、 B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。可商品化购得连接有荧光染料的 第二抗体，例如山羊F(ab'）2抗-人IgG-FITC可购自Tago免疫公司（Burlingame，CA)。
[0146] 间接标记物包括本领域熟知的各种酶，如辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶 (AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。例如，可采用辣根过氧化物酶检测系统与生色底物四甲基联 苯胺（TMB)，在存在过氧化氢时，以450nm检测产生的可溶性产物。例如，可采用碱性磷酸酶 检测系统与产色底物对-硝基苯磷酸盐，产生405nm处容易检测的可溶性产物。类似地，可 采用β-半乳糖苷酶检测系统与其产色底物邻-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG)， 产生410nm检测的可溶性产物。可采用脲酶检测系统与其底物，如尿素-溴甲酚紫（西格 玛（Sigma)免疫化学公司；St. Louis，MO)。连接酶的有用第二抗体可获自一些商品化来源， 如购自杰克逊免疫研宄公司（Jackson ImmunoResearch)(宾夕法尼亚州西格鲁甫）的山羊 F(ab'）2抗-人IgG-碱性磷酸酶。
[0147] 可分析直接或间接标记物产生的信息，例如用分光光度计检测产色底物产生的颜 色，用幅射计数仪检测幅射光，如用γ计数器检测 125I;或在存在某些波长光时用荧光计检 测荧光。对于酶联抗体的检测，可用分光光度计，如EMX微孔板读数仪（加利福尼亚州门 洛帕克的分子装置公司（Molecular Devices))按照厂商说明书进行抗-TNFa抗体含量或 ADA水平的定量分析。如果需要，可使本发明的试验自动化或用机器人进行，而可同时检测 多个样品产生的信号。
[0148] 在某些实施方式中，采用分子大小排阻层析。SEC的原理是：大小不同的颗粒将以 不同速率通过静止相洗脱（过滤）。导致溶液中的颗粒依据其大小而分离。条件是，同时或 近乎同时加载所有的颗粒，同样大小的颗粒在一起洗脱。每种分子大小排阻层析柱都有其 可分离的分子量范围。排阻界限的定义是此范围的上端分子量，如果分子太大则不能被静 止相捕获入其中。渗透界限的定义是此分离范围的下端分子量，如果分子足够小则可全部 渗透入静止相的孔中，低于此（下端）分子量的所有分子都很小，它们以一条带洗脱。
[0149] 在某些方面，收集恒定体积的洗脱液或组分。颗粒的大小越相似，它们越可能在同 一洗脱组分中而不能分别检测。优选以光谱学技术检测收集的组分，以测定洗脱颗粒的浓 度。本发明可用的光谱检测技术通常包括但不限于：荧光比色法、折射率（RI)和紫外线辐 射（UV)法。在某些情况下，洗脱体积的减少大约与分子流体力学体积的对数线性相关（即 较重部分先洗脱）。
[0150] 在某些方面，采用所述方法检测抗-TNFa药物，例如抗体的含量，包括 REMICADE? (英夫利昔单抗）、嵌合型抗-TNF α单抗、TNFR-IgFc融合蛋白ENBREL? (依那西 普）、人抗-TNF α单抗HUMIRA?(阿达木单抗）和PEG化Fab片段CIMZ丨Α? (赛妥珠单 抗）。
[0151] 在某些情况下，检测到抗-TNFa药物（如抗-TNFa抗体）后，用标准曲线测量这 种抗-TNFa药物。
[0152] 在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或 水平的方法，所述方法包括：
[0153] (a)使标记抗-TNF a药物与样品接触，与自身抗体形成标记的复合物；
[0154] (b)所述标记复合物进行分子大小排阻层析以分离所述标记复合物；和
[0155] (C)检测标记复合物的存在或水平，从而检测自身抗体。
[0156] 在某些情况下，所述自身抗体包括：人抗-嵌合抗体（HACA)、人抗-人源化抗体 (HAHA)和人抗-小鼠抗体（HAM)。
[0157] 在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或 水平的方法，包括：
[0158] (a)使标记抗-TNF a药物和标记TNF a与含有或怀疑含有抗-TNF a药物自身抗 体的样品接触，在标记抗-TNF a药物，标记TNF a与自身抗体之间形成第一标记复合物，和 在标记抗-TNF a药物与自身抗体之间形成第二标记复合物，其中标记抗-TNF a药物和标 记TNFa所含的标记不相同；
[0159] (b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析以分离第一标记复 合物与第二标记复合物；和
[0160] (C)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当存在第一标记复合物和第二 标记复合物二者时检测非中和形式的自身抗体，和当只存在第二标记复合物时检测中和形 式的自身抗体。
[0161] 在某些情况下，所述自身抗体包括：人抗-嵌合抗体（HACA)、人抗-人源化抗体 (HAHA)和人抗-小鼠抗-TNF a药物抗体（HAM)。
[0162] 在一相关的实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的方法， 包括：
[0163] (a)使标记抗-TNF a药物与含有或怀疑含有抗-TNF a药物自身抗体的样品接触， 在标记抗-TNF a药物与自身抗体之间形成第一标记复合物；
[0164] (b)使第一标记复合物通过分子大小排阻层析柱，而分离第一标记复合物；
[0165] (C)检测第一标记复合物，从而检测自身抗体的存在或水平；
[0166] (d)使标记TNF a与第一标记复合物接触，形成标记抗-TNF a药物与标记TNF a 之间的第二标记复合物，其中标记抗-TNF a药物和标记TNF a所含的标记不相同；
[0167] (e)第二标记复合物进行第二分子大