柱温 35°C，进样量 5yL。
[0042] 梯度洗脱条件：0 ~Imin, 98%A~98%A;1. 1 ~3.Omin, 2%A~2%A;3. 01 ~ 4.Omin, 98%A~98%A。
[0043] 质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压（IS) :2. 6kV;离子化温度350°C;雾化气流 量：1000L/Hr;锥孔气（cone)流量50L/Hr;碰撞气流量为0. 15ml/min;碰撞气为氩气，其 余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，选取m/z177. 2/98. 0作为定量 尚子对，m/z177. 2/80. 1为确认尚子对，m/z180. 2/80. 1为对应的氣代内标尚子对（可替 宁-d3)。
[0044] (2)标准储备液的配制：
[0045] 称取14. 3mg可替宁标准品于IOmL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到I. 43mg/mL的 可替宁甲醇溶液。准确移取69yL上述储备液于IOmL容量瓶，用甲醇定容，得10yg/mL的 可替宁甲醇溶液。量取10Ug/mL的可替宁lmL，用甲醇定容到10mL，得到Iyg/mL的可替 宁甲醇溶液。
[0046] 称取IOmg可替宁_(13标准品于IOmL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到lmg/mL的 可替宁_(13甲醇溶液。准确移取10yL上述储备液于IOmL容量瓶，用甲醇定容，得到Iyg/ mL的可替宁-d3甲醇溶液。
[0047] (3)可替宁含量的测定：
[0048] 吸取配制好的不同浓度的可替宁的混合标准工作溶液各5yL，注入LC-MS/MS;可 替宁的线性回归方程分别为y= 0. 0036x-0. 0002,其中y代表分析物与内标峰面积的比值， X表示尿液中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中可替宁的含 量。
[0049] (4)该方法的线性范围和检出限：
[0050] 本实验空白尿液基质配制标准曲线，分别移取Iyg/mL标准储备液0yL，IyL， 2yL, 5yL, 20yL，50yL，100yL和500yL于8个I. 8mL旋盖色谱瓶中，每个色谱瓶移入 30yL氘代内标工作液（Iyg/mL)，用乙腈定容至lmL。各标准工作溶液的浓度分别为Ong/mL，lng/mL，2ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL,lOOng/mL和 500ng/mL。对各标样峰面积与 内标的峰面积的比值（y)和其浓度（X)进行线性回归分析，得到回归方程为，化合物线性关 系良好（相关系数r2多0.99)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出 限为 0. 209ng/mL。
[0051] (5)本发明方法的重复性和加标回收率：
[0052] 采用尿液基质加标准品的方法测方的回收率。选取一个非吸烟者尿液样本，在尿 液样品中添加一定量的可替宁标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、 低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，计算6次结果的平均值，低中高添加 水平的回收率分别为94. 3%，99. 9%和95. 1%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差 (RSD)来评价，对同一样品平行测定6次，可替宁的RSD范围为1. 0 %~3. 2 %，结果见表1。
[0053] 表1空白尿液中可替宁的回收率和精密度（n= 6)
[0054]
【主权项】
1. 一种测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤a) 移取尿液于离心管，加入氘代内标，用乙腈稀释； 步骤b) 将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经有机相滤膜过滤，滤液待 测； 步骤c) 用甲醇配置可替宁标准储备液，低温避光保存；取一定量的储备液，用甲醇稀释定容， 制得可替宁工作液； 用甲醇准确配置可替宁-d3内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，低温避光保 存，使用前将其恢复到室温； 用乙腈配制不同浓度的可替宁标准工作溶液； 步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定 吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，按内标法以峰 面积计算出样品待测液中可替宁含量。
2. 根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，步骤a)中，内标 浓度为10Ug/mL，加入尿液样品、内标、乙腈的体积依次为100yL，30yL和870yL。
3. 根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，步骤b)中，涡旋 振荡 2min，2400 转 /min。
4. 根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，步骤c)中，所述 低温避光保存为：选用棕色玻璃瓶作为容器，放入_20°C保存。
5. 根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，所述步骤d)中 测定尿液中可替宁含量的具体操作为：吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注 入UPLC-MS/MS系统，绘制可替宁的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定， 测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含 量。
6. 根据权利要求1或5所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，所述 UPLC-MS/MS系统的测定条件中： 色谱条件：选用色谱柱AtiantisUPLCBEHShieldRPC18,规格为 50mmX2. 1mm， I. 7ym;流动相A:体积分数为0.I%的甲酸水溶液，流动相B:0. 1%甲酸甲醇溶液；流速 0. 8mL/min，柱温35°C，进样量5yL;梯度洗脱。
7. 根据权利要求6所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，所述梯度洗脱 条件：0 ~Imin, 98%A~98%A;1. 1 ~3.Omin, 2%A~2%A;3. 01 ~4.Omin, 98%A~ 98%A0
8. 根据权利要求1或5所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，所述 UPLC-MS/MS系统的测定条件中： 质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压（IS) 2. 6kV;离子化温度350°C;雾化气流量 1000L/Hr;锥孔气流量50L/Hr;碰撞气流量为0. 15ml/min;碰撞气为氩气，其余气体为氮 气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，选取m/z177. 2/98. 0作为定量离子对，m/z 177. 2/80. 1为确认离子对，m/z180. 2/80. 1为对应的氘代内标离子对。
9.根据权利要求1所述的测定尿液中可替宁含量的方法，其特征在于，所述尿液为冷 冻保存尿液，测定前在室温下解冻。
【专利摘要】本发明公开一种测定尿液中可替宁含量的方法，包括以下步骤：移取尿液于离心管，加入氘代内标，用乙腈稀释；将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经有机相滤膜过滤，滤液待测；配制储备液和工作液，采用超高效液相色谱-串联质谱测定。与传统的气相色谱-质谱法比较，本发明采用乙腈直接稀释，涡旋振荡过滤进样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
【IPC分类】G01N30-06, G01N30-02
【公开号】CN104764826
【申请号】CN201510172247
【发明人】熊巍, 陶晓秋, 韶济民, 张海燕, 庞夙, 黄玫
【申请人】中国烟草总公司四川省公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月13日