一种荧光微球免疫层析试纸条的制备及定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学检测领域，具体是涉及一种英光微球免疫层析试纸条的制备 方法及定量检测方法。 技术背景
[0002] 在生物和医学检测中，经常用到免疫分析法，它包括放射免疫分析、酶联免疫分析 及免疫层析等方法。放射免疫分析和酶联免疫分析法需要昂贵的设备、专业的操作人员和 复杂的操作步骤，难W快速得到检测结果。免疫层析法因操作简单、快速和成本底，而常用 于快速定性或半定量检测，如盐酸克伦特罗、己肝表面抗原、黄曲霉毒素和促黄体激素等胶 体金试纸条。目前我国艾滋病、己肝、丙肝、梅毒等常见传染性疾病的发病率不断上升，给社 会和人民生活安全造成极大隐患。而基于免疫层析技术的产品因操作简便、快速和只需肉 眼观察或简单仪器就能显示结果，可作为疾病或违禁添加物检测的初步筛选方法。因此，开 发基于免疫层析技术的产品有利于缓解目前我国也血管疾病、艾滋病、己肝、丙肝和梅毒等 常见传染性疾病发病率日益上升的情况。
[0003] 免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常W条状 纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测 物与层析材料上针对待测物的受体（如抗体或抗原）发生高特异、高亲和性的免疫反应。层 析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶反应或直接 利用可目测的标记物（如胶体金）所看到的直观的实验现象（如显色）而获得测定结果。 而游离标记物（即未与待测物结合的标记物）则越过检测带，达到与结合标记物自动分离 之目的。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体砸、明胶等，其中运用最成功的 标记物为胶体金。但胶体金免疫层析技术尚存在W下不足：
[0004] (1)胶体金标记过程是静电吸附过程，属于物理吸附，在液相中稳定性较差，己标 记上的蛋白分子容易再次脱落。
[0005] (2)只有当金颗粒达到一定量时，肉眼才能分辨出检测条带与背景差异，因而检测 灵敏度不高。
[0006] (3)不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。
[0007] (4)胶体金免疫层析技术一般用于定性或半定量检测。
[0008] 胶体金免疫层析技术检测灵敏度较低，在实际检测中只能对检测测物定性或半定 量，无法准确定量。目前，己有相关专利报道了W英光纳米微粒为标记物进行免疫层析检 巧IJ，如公开号为CN1645146A的专利公开了一种用英光稀±纳米颗粒作为标记物的免疫层 析方法及其检测试纸条的制备。公开号为CN1866012A的专利公开了一种定量、快速的免疫 检测方法及其专用装置，该方法将英光物质藝合物化化3\Dy3+与有机高分子纳米微 粒结合，制备成英光微粒，通过英光检测来进行定量。该些专利公开的方法都能提高免疫层 析检测的灵敏度，但报道的英光纳米颗粒存在一定的缺陷，如染料容易泄露、抗溶液干扰能 力差等，从而应用范围在很大程度上受到了限制。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种灵敏度高、简便和快速的英光微球免疫层析试纸条的制 备方法及定量检测的方法。本发明使用的英光微球不受外界环境的影响，因而英光稳定，为 通过英光进行定量检测提供了良好的条件。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是；一种英光微球免疫层析试纸条的制 备方法，包括W下步骤：
[0011] (1)英光微球垫的制备；称取0. 009g过硫酸钟，0. 004g化肥化溶于7ml去离子水 水中，将一定质量的英光染料溶于2ml无水己醇及1ml苯己帰后，加入到水溶液中，摇匀，通 氮气5min，放入70°C恒温水浴震摇2化后，取出，离也（1000化pmXlOmin)分离出的聚合物 分别用己醇、去离子水离也洗涂3次，即得到聚苯己帰英光微球。用制备的英光微球来标记 抗体、抗原或其它特异性结合物质，并将其喷涂在玻璃纤维膜上。
[001引似硝酸纤维素膜（NC膜）的制备；将抗体、抗原或其它特异性结合物质包被到硝 酸纤维素膜上制成检测区，将另一种抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上制成质控区。
[0013] (3)组装和剪切；在粘性底板上依次搭接地粘贴；滤纸、样本垫、英光微球垫、硝酸 纤维素膜W及吸水纸，并剪切成适当宽度即成为免疫层析试纸条。
[0014]所述英光微球直径为30-150nm
[00巧]所述活性基团为-C册、-C00H、-0H、-NH;或-SH
[0016]所述英光物质为有机钉化合物、异硫氯酸英光素、异硫氯酸罗丹明、6-梭基英光素 駄胺酷、英光焼衍生物类、1，8-蔡二駄亚胺类、香豆素类有机英光染料或其惨杂物W及量子 点
[0017]本发明的另一个技术方案提供了用英光微球免疫层析试纸条制备英光微球免疫 层析检测卡的方法。
[0018]将一或多张免疫层析试纸条并排固定在底卡上，然后在试纸条表面用面卡压紧， 即成为免疫层析检测卡。底卡和面卡一般都选用为塑料卡，底卡能使试纸条上的样本垫、英 光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水纸紧密结合，面卡可保护试纸，使其不受损坏。面卡上预留 加样孔和观察窗，加样孔的位置与试纸条的样本垫对应，观察窗的位置与试纸条的NC膜对 应。
[0019]本发明还提供了一种利用英光微球免疫层析检测卡定量检测方法，包括W下步 骤：
[0020] (1)绘制标准曲线；配制一系列不同浓度（X)的标准品溶液（浓度5个W上）， 用同一批次的数张免疫检测卡检测标准品溶液，得到检测线英光强度（y)W及标准质控线 英光强度C。，W标准品溶液的浓度为横坐标，检测线英光强度为纵坐标，绘制一条标准曲线 y=ax+b，在英光分析仪中记录此标准曲线和标准质控线英光强度C。。
[0021] (2)免疫层析检测卡的加样孔中加入待检样本，反应3-20min后，将检测卡放入检 测窗口。
[0022] (3)截留在检测区和质控区的英光微球在灯源激发下，发出强烈的英光。
[0023] (4)发射的英光经滤除杂光后，通过聚焦系统将采集的光学信号，送入光电倍增 管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，获得检测线与质控线的英光强度。
[0024] (5)将获得的质控线英光强度与英光分析仪中内置的质控线英光强度进行校正， 得到本次待检样本测定时的校正系数，消除检测样本中的基质干扰效应。
[0025] (6)将获得的检测线英光数值乘W校正系数，并将所得数值代入已设置在英光分 析仪中的标准曲线，即得到样本中待测物的浓度，W上过程通过英光分析仪内置分析软件 自动计算获得。
[0026] 本发明中所述的校正原理如下：
[0027] 绘制标准曲线时的质控线英光强度为C。，而实际样本检测时的质控线英光强度为 C，检测线英光强度为T，因质控线差异与待检物浓度无关，只与检测条件有关，因此可用于 校正到绘制标准曲线时的检测线的英光强度T。。检测线的英光强度T。可通过下列公式计 算出来：
[0028]
[0029] 将校正值T。代入标准曲线y=x+b，即可得出样本中待测物的浓度，W上过程通过分 析仪内置分析软件自动计算获得。
[0030] 本发明中所述的免疫层析试纸条上的免疫反应包括两种模式；夹也模式和竞争模 式。
[0031] (a)夹也模式；可用于检测样品中存在的病原体、微生物W及大分子抗体、抗原 等；包括双抗体夹也和双抗原夹也，两者原理相同，现W双抗体夹也为例进行说明。
[0032] 在免疫层析试纸条的制备过程中，首先将英光微球标记的待测物特异性抗体 A(特异性结合于待测物A位点的抗体）喷涂在玻璃纤维膜上制成英光微球垫；然后将待测 物特异性抗体B(特异性结合于待测物B位点）固定于硝酸纤维素膜上作为检测带，将二抗 (可与抗体A特异性结合的抗体）固定于硝酸纤维素膜上作为质控带。
[0033] 当样品垫上加入样品时，待测物首先和英光微球垫上的英光微球-抗体A相结合， 形成免疫复合物（英光微球-抗体A-待测物）；然后在毛细作用下，免疫复合物W及游离的 英光微球-抗体A跟随样品中的液体基质一起进入NC膜；当经过检测带时，检测带上的抗 体B将与免疫复合物中待测物上的B位点结合形成英光微球-抗体A-待测物-抗体B复 合物，并且固定在检测带上，而游离的英光微球-抗体A不与抗体B结合，在毛细作用下继 续流动，当经过质控带时，与二抗结合并固定于质控带上。用英光分析仪检测检测带与质控 带的英光强度，其中检测带上的英光强度与待测物浓度成正比。
[0034] 化）竞争模式：可用于检测样品中存在的小分子抗原
[0035] 在免疫层析试纸条的制备过程中，将英光微球与待测物特异性抗体A相结合，并 喷涂在玻璃纤维膜上制成英光微球垫；将与待测物相