同的抗原（均含有抗体A可特异性结 合的A位点）固定于NC膜上作为检测带，将二抗（可与待测物特异性抗体A特异性结合 的抗体）固定于NC膜上作为质控带。当样品垫上加入样品时，样品中的待测物与英光微 球-抗体A结合，形成复合物英光微球-抗体A-待测物；在毛细作用下，复合物W及游离 的英光微球-抗体A与样品中的液体基质-起进入NC膜；当经过检测带时，游离的英光微 球-抗体A与检测带上的抗原结合形成免疫复合物并且固定于检测带上，而复合物英光微 球-抗体A-待测物不与检测带上的抗原结合，在毛细作用下继续流动；当经过质控带时，抗 体A与二抗发生免疫反应，并把英光微球一抗体A-待测物固定于质控带上。用英光分析仪 检测检测带与质控带的英光强度，其中检测带的英光强度与待测物浓度成反比。
[0036] 本发明的优点如下：
[0037] 1.英光物质被特定波长激发激发后，发生斯巧克斯位移效应，能在较大波长发射 光，因此英光不受来自激发光本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见分光光度法，其灵敏 度是用传统染料和有色标记物质检测方法的10-1000倍。英光标记检测方法与该两种方法 相比，还具有操作简便，检测快速，价格低廉等优点。
[0038] 2.英光微球是一种核壳双结构二氧化娃纳米粒子，有机染料位于内核，不受外界 环境的影响，因而英光稳定，为通过英光进行定量检测提供了良好的条件，有力的克服了常 规英光微球的染料易泄露，抗溶液干扰能力差等缺点，增加了英光稳定性和英光寿命，扩大 了可检测物的范围和种类。
[0039] 3.英光微球表面易修饰活性基团，可采用化学偶联方法标一记抗体或抗原，形成 抗体或抗原与微球的稳定结合。
[0040] 4.通过CCD扫描技术或光纤技术将过滤后的发射光谱收集后，进行光电和模/数 转换，再经过软件处理，最后W数字显示待测物浓度，从而实现定量检测。
【附图说明】
[0041] 图1是免疫层析试纸条的结构示意图
[0042] 图2是免疫层析检测卡的结构示意图
[0043] 图3是英光微球免疫层析试纸检测原理图
[0044] 图4是一种简易英光检测仪的检测原理及其结构示意图
[0045] 如图1所示，该免疫层析试纸条的构成为；在粘性底板18上，依次搭接地粘贴滤纸 11、样本垫12、喷涂有英光微球标记的抗体或抗原的玻璃纤维膜13、硝酸纤维素膜14、和吸 水纸17,其中在硝酸纤维素膜14上有包被抗体或抗原的检测区巧和包被有另一种抗体或 抗原的质控区16。
[0046] 如图2所示，该免疫层析检测卡是单卡型的，由一张免疫层析试纸条固定在底卡 上而形成，具体构造包括底卡21、面卡22、加样孔23、观察窗24、NC膜25、质控线26、检测 线 270。
[0047] 如图1、2和3所示，检测原理如下：在样本垫12上滴加样品，样品溶解玻璃纤维 膜13上喷涂的英光微球标记抗体或抗原，通过毛细作用在纤维膜上向前泳动，同时样品中 的待测物质与英光微球标记物反应；反应溶液经过检测区巧时，与检测区的包被物结合，而 富集于该检测区；将试纸条放入检测窗口 41，英光微球43在光源42激发下，发射的英光44 通过单色光滤光片35滤过后，通过观察窗口 36在检测区15能够观察到一条清晰的英光条 带。
[0048] 如图4所示，英光微球免疫层析检测卡定量检测的检测步骤如下：
[0049] (1)在检测卡的加样孔23中加入待检样品，反应lOmin后，将其放入检测窗口 41。
[0050] (2)检测区和质控区被截留的英光微球43在最佳激发光源42激发下，发出强烈的 英光。
[0051] (3)发射的英光44经CCD扫描系统或光纤系统45汇聚后，经过光电聚集管46,送 入光电倍增管47,光信号得到增强，再经过信号转换元件48W及软件分析49处理后，样品 中待测物的浓度在数据输出410的显示屏上显示。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0052] ：
[0053] 1、罗丹明B正辛醋-聚苯己帰英光微球的制备
[0054] 称取0. 009g过硫酸钟，0.OOAgNaHCA溶于7ml去离子水水中，将Img罗丹明B正 辛醋溶于2ml无水己醇及1ml苯己帰后，加入到水溶液中，摇匀，通氮气5min，放入7(TC恒 温水浴震摇2化后，取出，离也（l〇〇(K)巧mXlOmin)分离出的聚合物分别用己醇、去离子水 离也洗涂3次，即得到罗丹明B正辛醋-聚苯己帰英光微球。
[0055] 2、标记CRP单抗S1的英光微球的制备巧DC法）
[0056] 取Img包裹罗丹明B正辛醋英光素的英光微球在lOOOXg离也10-15min，收集沉 淀，用0. 01MpH4. 8的测酸盐缓冲液调节微球浓度为0〇45。=〇. 2。然后加入90yL50mg/血 对己基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺巧DC)，150yL5mg/血氮经基嘘拍駄亚胺（N服），振荡 混匀，室温赔育10-30min后，lOOOXg离也5-15min，沉淀用0. 01MpH4. 8的测酸盐缓冲液 溶解，并调节微球浓度为〇〇45。。为0. 2-1。将0. 1血英光微球中加入1-10yLCRP单抗Cl， 充分混匀后，室温揽拌反应化，分别用超纯水洗涂离也3次后，沉淀用0. 01MpH7. 2的PBS 溶液（其中包含5%藏糖和0. 05%Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，即为制备好的标记 CRP单抗Cl的英光微球。
[0057] 3、英光微球垫的制备
[0058] 用BI0D0TDispensingSystem,将标记CRP单抗。的英光微球按照4yL/cm的量 喷涂至玻璃纤维膜（30X0. 8cm)上，25C真空干燥1-化，放于干燥环境备用。
[0059] 4、硝酸纤维素膜（NC膜）的制备
[0060] 用0. 01MpH7. 4PBS(磯酸盐缓冲液，其中包含5%藏糖和0. 05%Tween-20)调 节CRP单抗C2的浓度为0. 5mg/mU将所得溶液喷涂在NC膜上形成检测线；用0. 01M pH7. 2PBS(磯酸盐缓冲液，其中包含5%藏糖和0. 05%Tween-20)调节抗鼠抗体的浓度为 0. 5mg/mL，将所得溶液喷涂在NC膜上形成质控区。两区的喷膜量均为0. 74yL/cm,两区 相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37 °C烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
[0061] 5、英光微球免疫层析检测卡的制备：
[0062] 组装试纸条；在PVC底板上依次搭接地粘贴；（1)滤纸和样本垫，样本垫为一种经 过5%Tween-20处理的玻璃纤维膜；（2)喷涂有英光微球标记的CRP单抗Cl的英光微球垫； (3)有喷涂CRP单抗C2作为检测区和抗鼠抗体作为质控区的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸，组 装完成后剪切成4mm的宽度，即成为免疫层析试纸条。
[0063] 把一张免疫层析试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用面卡压紧，面卡在对应试 纸条的样本垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗。免疫层析检测卡组装好后装入铅 铅袋中，加入干燥剂后封口保存，于室温干燥环境下至少可W保存一年。
[0064] 6、英光微球免疫层析定量检测人血清CRP浓度：
[0065] 标准曲线的绘制：将CRP标准品配制成一系列浓度巧个W上），用同一批次的数 张免疫层析检测卡检测各浓度的标准品溶液。W检测线的英光强度为纵坐标，CRP标准品 溶液浓度为横坐标，绘制一条标准曲线。将标准曲线和对应的标准质控线英光强度保存在 英光分析仪中。
[006引样品的检测：
[0067] (1)平放检测卡，待测血清平衡至室温后，取其50yL加入加样孔中，于室温下反 应lOmin，将检测卡放入检测窗口。
[0068] (2)截留在检测区和质控区的英光微球在最佳激发光源的激发下，发出强烈的英 光。
[0069] (3)发射的英光经滤除杂光后，通过聚集系统将采集的光学信号，送入光电倍增 管，光信号得到增强，再经过信号转换元件，获得检测线与质控线的英光数值。
[0070] (4)英光分析仪中的内置分析软件对检测线英光强度进行校正，并把校正值代入 内置标准曲线，自动计算出待测血清中CRP浓度为3. 02ng/mL。
[0071] 取10个待检血清样本，分别用本发明所述的英光微球免疫层析检测卡和化ISA检 测，
[007引将两种方法的检测结果进行比较，结果如下；单位为ng/mL
[0073]
[0074] 两组数据的相关系数是r=0. 9913,表明该两种方法的检测结果显著相关。本发明 所述的英光微球免疫层析检测卡可用来进行快速定量检测CRP。
[00巧]实施