所述电极放入三聚氯氰溶液中，冰浴条件下，搅拌反应2小时得到连接臂三聚氯氰固定的电极。
[0047]3)称取0.05g儿茶素，溶解在装有15ml丙酮的三口圆底烧瓶中，将烧瓶置于37°C水浴中，搅拌5分钟，使儿茶素固体完全溶解。
[0048]4)将连接臂固定的电极使用丙酮溶液冲洗三次，然后将所述电极放入儿茶素溶液中，37°C水浴条件下，搅拌反应3小时得到儿茶素固定的电极。
[0049]第三步:AChE酶固定
[0050]DAChE酶溶液的配置:溶解AChE所用溶液为pH = 7.40.lmol/L,体积比PBS:甘油=3:2的混合溶液。该PBS缓冲溶液为磷酸根浓度为0.lmol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液，利用磷酸根与磷酸氢根调节pH为7.4。分别取6ml上述PBS溶液和4ml甘油混合，将混合物超声30分钟至完全混溶。取Iml体积比pH = 7.40.1M PBS:甘油=3:2的混合溶液，加入到500U的AChE中溶解。然后将溶解后的AChE置于_20°C条件下保存。
[0051]2)将儿茶素固定化的电极使用超纯水清洗三次，然后将电极置于室温下晾干。取5 μ I酶液，滴涂到所述电极表面，将电极置于4°C冰箱中过夜反应，得到基于儿茶素定向化固定AChE生物传感器。
[0052]以上第一至第三步均采用交流阻抗法进行表征。电化学仪器为上海华辰仪器有限公司产CHI660E，分析软件为CHI660E自带软件。采用三电极系统:工作电极(第一至第三步制备的电极)、饱和甘汞电极为参比、铂丝电极为对电极。电解液:0.1M KC1，含浓度均为5mmol/L的Fe3+和Fe 2+，电位0.168v，频率范围:10 1?10 5，对每步修饰进行表征。结果见图2。由图2可知曲线I是裸玻碳电极，阻抗值300Ω。曲线2的电极是裸玻碳电极修饰了壳聚糖，阻抗值减小到不到100Ω。这是因为壳聚糖带有大量氨基，氨基带正电荷会促进电子的传递，从而使阻抗减小。曲线3的电极是曲线2的电极修饰了三聚氯氰，由于不导电物质的加入，使得曲线3的电极的阻抗有轻微增长(原图为彩色，本图2中曲线和3基本重合)。曲线4的电极是曲线3的电极修饰了儿茶素，由于儿茶素的加入使得阻抗值进一步增大。曲线5的电极是修饰了 AChE酶，由于酶的加入阻碍了电极表面电子的传递，使得阻抗值明显增大。也进一步说明酶被固定在了电极表面。
[0053]实施例2:循环伏安法测试生物传感器性能
[0054]采用三电极系统:工作电极(实施例1三个步骤制备的生物传感器)、饱和甘汞电极、铂丝电极。电解液:将0.0198g ATCl溶解到10ml0.1M pH = 7.5PBS溶液中得到ImM的ATC1，以及空白PBS溶液。循环伏安法:将三电极系统放于ImM ATCl溶液中，扫描范围为-0.6?1.0V，扫描速度为50mV/s，得到修饰电极的循环伏安图。
[0055]结果为图3。图3中从上向下的曲线分别为:1为玻碳电极(GCE) +壳聚糖(CS) +三聚氯氰(CC) +儿茶素(CA)+AchE酶电极在空白PBS中循环伏安图，2为GCE+CS+酶在含有ImMATCL的PBS溶液中的循环伏安图，3为GCE+CS+三聚氯氰+酶在含有ImMATCL的PBS溶液中的循环伏安图，4为GCE+CS+三聚氯氰+儿茶素+酶在含有ImMATCL的PBS溶液中的循环伏安图。
[0056]分析图3可以看出，I和4对比，当GCE+CS+CC+CA+AChE酶电极在空白PBS中做循环伏安图的时候并没有出现氧化电流，说明没有酶催化反应的发生。当GCE+CS+CC+CA+AChE酶电极在含有ImMATCL的PBS溶液中时，可以明显看到有一个氧化电流峰的出现，说明产生了酶催化反应。另外将GCE+CS+CC+CA电极同样放置在含有ImMATCL的PBS溶液中，但是效果同I。这就表明氧化峰的出现是源于AChE酶对底物ATCL特异性催化产生的。
[0057]对比2、3、4我们发现，不管是壳聚糖直接吸附AChE酶，还是三聚氯氰共价固定AChE酶，产生的氧化电流峰的大小都没有使用儿茶素定向化固定的AChE酶产生的氧化电流强。这就说明儿茶素定向固定的方法固定的酶活性更高。
[0058]实施例3:计时电流法测试生物传感器性能
[0059]计时电流法:将和实施例2相同的三电极系统放于空白PBS (0.1M pH = 7.5)，检测电位:0.68v，扫描时间600s。每隔一段时间加入一定量ATC1，得到计时电流图。
[0060]分析图4，传感器对底物乙酰胆碱的检测线性范围分别为I X 10 6mol/L?1.3X105mol/L，1.67X 10 5mol/L?4.3X105mol/L。浓度-电流的数学关系分别为 y =
0.098x+-3.29751E-4，R2= 0.996。y = 0.06x+0.6，R 2= 0.999。
[0061]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种基于AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括步骤: 1)玻碳电极表面修饰:玻碳电极在硫酸溶液中用循环伏安法活化，然后以壳聚糖修饰电极表面； 2)儿茶素固定:将步骤I)制得的壳聚糖修饰的玻碳电极置于三聚氯氰溶液中，_5°C?5°C温度下处理I?3小时得到连接臂三聚氯氰固定的电极，然后再将所述连接臂三聚氯氰固定的电极置于儿茶素溶液中30°C?40°C温度下处理2?4小时； 3)AChE酶定向固定:溶解AChE所用溶液为PBS缓冲溶液和甘油体积比为2?4:2的混合溶液，所述PBS缓冲溶液的pH = 7.0?7.8 ;每ImL所述混合溶液中溶解500U的AChE，然后用于修饰步骤2)固定了儿茶素的电极的表面。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，玻碳电极首先以Al2O3浆抛光，然后蒸馏水冲洗、超声清洗，再依次在硝酸、乙醇、水中超声清洗，用氮气吹干。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，玻碳电极在0.1?1.0mol/L硫酸溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.6?1.0V,扫描速度为50mV/s ;扫描后在0.lmol/L KCl中记录I X 10 3mol/L的K3Fe (CN)fr^液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/s，扫描范围-0.2?0.8V ;当所述循环伏安曲线中的峰电位差在SOmv以内，所述玻碳电极处理成功，否则重新返回用循环伏安法活化。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中壳聚糖为溶液形式，滴涂到玻碳电极表面，然后干燥；壳聚糖溶液是将I?1g壳聚糖放入10ml质量分数1%的醋酸溶液中配制而得，每平方毫米玻碳电极修饰壳聚糖溶液的体积为0.2?2 μ L。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的三聚氯氰溶液为按照质量体积比0.05g:10?20mL三聚氯氰溶于丙酮的溶液。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的儿茶素溶液为按照质量体积比0.05g:10?20mL儿茶素溶于丙酮的溶液。7.根据权利要求1?6任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中固定了儿茶素的电极用超纯水清洗后干燥，取溶解了 AChE酶的溶液滴涂到电极表面，每平方毫米玻碳电极滴涂溶液的体积为0.2?2 μ L ;然后将电极置于O?5°C温度下10?20小时，得到基于AChE酶定向固定的生物传感器。8.根据权利要求1?6任一所述的制备方法，其特征在于，以所述生物传感器为工作电极、对电极为铂、金、银电极中的一种，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极系统，用交流阻抗法、循环伏安法、计时电流法中的一种或多种方法检验制得的生物传感器的性能。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于， 所述循环伏安法为:将三电极系统置于ATCl溶液中，扫描范围为-0.6?1.0V,扫描速度为50mV/s，得到循环伏安图； 所述计时电流法为:将三电极系统放于空白PBS溶液中，检测电位:0.68v，扫描时间600s，间歇加入ATCl，得到计时电流图，根据响应电流跟加入ATCL的量做出来的线性曲线算出灵敏度。10.权利要求1?7任一所述的制备方法制得的生物传感器。
【专利摘要】本发明属于生物传感器领域，提出一种基于AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，包括步骤1)玻碳电极在硫酸溶液中用循环伏安法活化，然后以壳聚糖修饰电极表面；2)壳聚糖修饰的玻碳电极置于三聚氯氰溶液中，-5℃～5℃温度下处理，然后再置于儿茶素溶液中；3)每1mL所述混合溶液中溶解500U的AChE，然后用于修饰固定了儿茶素的电极的表面。本发明通过使用儿茶素作为一种定向固定分子，与AChE的催化活性中心相对的位置的特异性结合将酶定向的固定在电极表面，促使AChE生物传感器稳定性提高；酶催化中心的完全暴露，促使AChE催化活力高，最终得到一种新型、灵敏、酶活性高、稳定性好的AChE生物传感器。
【IPC分类】G01N27/26, G01N27/30
【公开号】CN105044172
【申请号】CN201510390301
【发明人】孙英, 李源清, 刁剑雄
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月6日