检测莠去津残留的酶联免疫试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶联免疫检测领域，具体设及一种用于检测莽去津残留的酶联免疫试 剂盒，其特别适于玉米、甘薦样本中莽去津残留的检测。
【背景技术】
[000引莽去津（Atrazine)，又名阿特拉津、莽去尽、阿特拉嗦、园保净，CsHmCINs，中文名 2-氯-4-乙胺基-6-异丙氨基-1，3, 5-S嗦，是选择性内吸前导型苗前、苗后除草剂，根吸 收为主，茎叶吸收很少，迅速传导到植物分生组织及叶部，干扰光合作用，使杂草致死，是目 前世界上使用范围最广、使用量最大的一种旱田除草剂，主要施用于玉米、高梁、果园和林 地等，用于防除一年生禾本科杂草，对某些多年生的杂草也有一定的抑制作用。在玉米等抗 性作物体内被玉米酬酶分解生成无毒物质，因而对作物安全。杀草作用和选择性同西玛津， 易被雨水淋洗至较深处，致使对某些深根性杂草有抑制作用。
[0003] 莽去津外观为白色的细粉末，不易溶于水，在水中的溶解度仅为33mg/l，易溶于多 数有机溶剂，在微酸性或微碱性的介质中比较稳定。对人体的皮肤和眼睛有刺激作用。莽去 津结构稳定、持效期长，加上多年的使用，在自然环境中不易被分解，已经形成了对±壤、水 体等自然媒介的污染，在±壤中，可被微生物分解，残效期视用药量、±壤质地等因素影响， 可长达半年左右，污染自然环境，而且还会残留在玉米、高梁、果蔬等农产品的根系及茎中。 研究发现莽去津的残留对水生动植物、两栖类生物、哺乳动物、人类细胞都有不同程度的损 害作用，可能对被其污染地区的水生生物生长繁殖产生影响，长期接触莽去津的人患前列 腺癌的比率要比平均水平高出3.5倍W上，可导致乳腺癌和卵巢癌的发生，也可能造成人 类血管系统发生问题和再生繁殖困难。已有的研究证明莽去津对动物的生殖功能有极大的 影响，已被世界野生动物基金会(WWF)列为环境荷尔蒙（内分泌干扰剂）的可疑物质，有扰乱 内分泌的作用，是人类潜在的致癌物。因此，对食品中莽去津的检测和监控具有重要的现实 意义。我国对莽去津在玉米和甘薦中的最高残留限量，制定了严格的标准，最大残留限量为 0.05mg/kg〇
[0004] 从现有技术和相关检测标准看，目前针对莽去津残留的检测方法主要是仪器方 法，最常用的方法是气相色谱法（GC)、高效液相色谱法（HPLC)和气-质联用法（GC-MS)等， 仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需 提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人 员，进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难W推广。
[0005] 近年来药物残留免疫检测技术已经在食品质量安全快速检测中，得到了广泛的应 用，且逐渐被人们所认可，酶联免疫检测技术具有样品前处理简单，检测快速、灵敏、特异性 好、准确度高、重复性较好等特点，非常适用于农产品中农药残留的快速检测，从而弥补仪 器检测的不足。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种能够检测莽去津残留的酶联免疫试剂盒，采用间接竞 争化ISA方法，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法和 试剂盒制备方法，该方法对玉米、甘薦的检测限为27yg/kg，灵敏度为1yg/kg。
[0007]本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、莽去津标准品溶液、酶标二抗、抗 体浓缩液、底物显色液A液、底物显色液B液、终止液、洗涂液、复溶液，所述包被原为莽去津 偶联抗原。
[0008]所述莽去津偶联抗原是由莽去津半抗原与载体蛋白偶联得到，所述莽去津半抗原 是由取代反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋 白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。
[0009]所述莽去津特异性抗体是W莽去津偶联抗原作为免疫原制备获得，所述莽去津特 异性抗体可为莽去津单克隆抗体或莽去津多克隆抗体，其中优选莽去津单克隆抗体。
[0010] 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，其中优选羊抗鼠抗抗体。
[0011] 所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性憐酸醋酶，其中优选辣 根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醒法或过舰酸钢法将标记酶与抗抗体进行偶联 得到的。
[0012] 为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括莽去津标准品溶液、底 物显色液A液和B液、终止液、洗涂液、复溶液。
[001引所述标准品溶液6瓶，浓度分别为0yg/L、1yg/L、3yg/L、9yg/L、27yg/L、81jig/Lo
[0014] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色剂由底物显色液A液和底物显色 液B液组成，A液为过氧化氨或过氧化脈，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为 l-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性憐酸醋酶时，所述显色液为对硝基憐酸盐 缓冲液，所述终止液为l-2mol/L氨氧化钢溶液。
[0015] 所述洗涂液优选为抑值7. 2-7. 5,含有0. 8%-1. 0%吐溫-20、0. 03%〇 -0. 05%。叠氮 化钢防腐剂、0. 1-0. 3mol/L的憐酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0016] 所述复溶液优选为抑值7.0、0.02mol/L的憐酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积 百分比。
[0017] 其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为抑值9. 2-9. 6,0. 1-0. 2mol/L的 碳酸盐缓冲液，封闭液为抑值7. 1-7. 5,含有1%-3%酪蛋白、0. 1-0. 3mol/L的憐酸盐缓冲 液，所述百分比为重量体积百分比。
[001引本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成10yg/ml，每孔加 入100y1，37°C避光解育化或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涂液洗涂1次，静置60s，甩掉 洗液并拍干，然后在每孔中加入150y1封闭液，37°C避光解育化，倾去孔内液体拍干，干燥 后用侣膜真空密封保存。
[0019]本发明的检测原理为： 在酶标板上预包被莽去津偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入莽去津特 异性抗体溶液，样本中残留的莽去津药物与酶标板上包被的莽去津偶联抗原竞争莽去津特 异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与莽去津药物的 含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中莽去津的残留量；同时根据酶标板上颜色 的深浅，与系列浓度的莽去津标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中莽去津残留量的浓 度范围。
[0020] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测莽去津残留量的方法，它包括 步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
[0021] 样品的前处理主要是为了从样品中获得莽去津溶液，从而用于后续的检测。
[0022] 本发明中用试剂盒检测时：包被原为莽去津偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标 准品溶液或样本溶液，加入酶标二抗和抗体混合液，溫育洗涂后，甩掉孔中液体，并W吸水 纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
[0023] 本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均 值(M)除W第一个标准溶液（0标准）的吸光度值（M。)，再乘W100%，即百分吸光度值。计算 公式为： 百分吸光度值（％)= (M/X)X100% W莽去津标准品溶液的浓度（yg/L)的对数为X轴，百分吸光度为Y值，绘制标准曲 线。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘W其对 应的稀释倍数即为样本中莽去津残留量大小。
[0024] 本发明中检测结果的分析，也可W采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
[0025] 本发明检测莽去津的酶联免疫试剂盒主要采用竞争化ISA方法定性或定量检测 样品中莽去津的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批 量样品；主要试剂W工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确 度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便 利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。
【附图说明】
[0026] 图1:莽去津半抗原合成路线图。
[0027] 图2 :莽去津半抗原结构鉴定图。
[002引图3 :试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0030] 实施例1试剂盒组分的制备 1、莽去津半抗原的制备 1.Og莽去津溶解于DMF中，在碳酸钟的催化下，与0. 47g漠乙酸叔下醋进行亲和取代 反应，萃取，有机相水洗，无水硫酸钢干燥蒸干，得到1. 13g莽去津叔下醋粗产物，经无水乙 醇重结晶纯化，得到中间体0. 84g。中间体在甲醇与水1:1混合溶剂溶解，加10ml稀盐酸， 60°C反应地。调节抑值到10,萃取除去反应杂质，分去有机相，水相加稀盐酸调节抑值到 4,乙酸乙醋萃取，浓缩蒸干，上硅胶柱，氯仿：甲醇=10:1洗脱分离，得到半抗原产物0. 49g。
[003"产物做核磁鉴定，数据如下；古NMR(CDCI3, 300M监）5 : 11. 0(S，1H,C00H)，3. 95 (m, 1H,CH)，4. 0(S,2H,-邸2-)，3. 12 (dd, 2H,-邸2-)，1. 07 (m, 9H,-邸3)， 鉴定结果说明莽去津半抗原合成成功。
[0032] 2、抗原的制备 免疫原制备一一莽去津半抗原与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到免疫原。
[0033] 称取