50mg半抗原溶解于3血DMF溶液中，加入各lOOmgEDC和畑S(溶于4血水 中）进行活化30分钟，加入到150-280mg载体蛋白BSA(溶于lOmL水中）进行偶联制备出 免疫原，用0. 02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，W除去未反应的小分子物 质；透析完成后用于动物免疫制备出抗体。分装，于-20°C保存备用。
[0034] 免疫原制备一一莽去津半抗原与卵清蛋白（OVA)偶联得到免疫原。
[0035] 称取50mg半抗原溶解于3血DMF溶液中，加入各lOOmgEDC和畑S(溶于4血水 中）进行活化30分钟，加入到150-280mg载体蛋白OVA(溶于lOmL水中）进行偶联制备出 免疫原，用0. 02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，W除去未反应的小分子物 质；透析完成后用于动物免疫制备出抗体。分装，于-20°C保存备用。
[0036] 3、莽去津单克隆抗体的制备 动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Ba化/c小鼠体内，免疫剂量为200yg/只， 使其产生抗血清。
[0037] 细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1 (数量配比）比 例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限 稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌莽去津单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0038] 细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成IX1〇6个/ml的细胞悬 液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离屯、去除冻存液后， 移入培养瓶内培养。
[0039] 单克隆抗体的生产与纯化：将Ba化/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后 腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5X1〇5个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸 锭法进行腹水纯化，-20°C保存。
[0040] 4、羊抗鼠抗抗体的制备 W羊为免疫动物，W鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。
[0041] 5、酶标记抗抗体的制备 将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP)采用改良后的过舰酸钢法进行偶联。
[004引 6、酶标板的制备 用包被缓冲液将包被原稀释成10yg/ml，每孔加入100y1，37°C避光解育化，倾去孔 中液体，用洗涂液洗涂1次，静置60s，甩掉洗液并拍干，然后在每孔中加入150y1封闭液， 37 °C避光解育化，倾去孔内液体拍干，干燥后用侣膜真空密封保存。
[0043] 实施例2检测莽去津的酶联免疫试剂盒的组建 组建检测莽去津的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分： (1) 包被莽去津偶联抗原的酶标板； (2) 莽去津标准品溶液6瓶，浓度分别为0yg/l、1yg/l、3yg/l、9yg/l、27yg/l、 81iig/L； (3) 莽去津单克隆抗体工作液； (4) 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体； (5) 底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脈，B液为四甲基联苯胺； (6) 终止液为2mol/L硫酸； (7) 洗涂液为抑值7. 2-7. 5,含有0. 8%~1. 0%吐溫-20、0. 03%〇 -0. 05%〇叠氮化钢防腐 剂、0. 1-0. 3mol/L的憐酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0044] (8)复溶液为pH值7. 0、0. 02mol/L的憐酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分 比。
[0045] 实施例3玉米、甘薦中莽去津的检测 1、样品前处理 样本前处理方法 试样经粉碎后，称取约l±0.05g试样，置于50mL聚苯乙締离屯、管中，加入6mL乙酸乙 醋，于电动振荡器上振摇5min，置于离屯、机内用4500;r/min离屯、5min，去上清液2ml于10血 玻璃试管，用氮吹仪吹干。用ImL复溶液溶解干燥物，溶解液可用于化ISA分析。
[004引 2.溶液的配置 复溶液的配置 用去离子水将复溶液按1 :1体积比进行稀释（1份复溶液+1份去离子水）用于样本的 复溶，复溶工作液在4°C(39. 2 了）环境可保存一个月。
[0047] 洗涂液的配置 用去离子水将洗涂液按1 :19体积比进行稀释（1份洗涂液+19份去离子水）用于酶标 板的洗涂，洗涂工作液在4°C(39. 2 了）环境可保存一个月。
[0048] 抗体浓缩液与酶标二抗液的混合 将抗体浓缩液和酶标二抗工作液W1:10的体积混合（即1份抗体浓缩液与10份酶标 二抗工作液混合)。注：现配现用。
[0049] 3、用试剂盒检测 向包被有莽去津偶联抗原的酶标板微孔中，加入莽去津标准品溶液或经前处理的样 品溶液50y1/孔，然后加入抗体浓缩液与酶标二抗工作液的混合液50y1/孔，轻轻振荡 混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min;倒出孔内液体，每孔加入250y1洗 涂液充分洗涂4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化氨 50y1，再加入底物显色液B液四甲基联苯胺（TMB) 50y1，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后 置25°C避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50y1，轻轻振荡混匀，用酶标仪双波 长450/630nm处，测定每孔吸光度值（OD值)。若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行 判定。
[0050] 4、检测结果分析 标准品或样本的平均吸光度值(双孔）除W第一个标准品（0标准）的平均吸光度值，再 乘W100%，得到标准品或样本的百分吸光度值。W标准品百分吸光率为纵坐标，W莽去津标 准品浓度（yg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线 中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘W其对应的稀释倍数即为样本中莽去津实际 浓度。
[0051] 实施例4莽去津技术参数的确定试验 1、试剂盒灵敏度和检测限 按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为1 准曲线的范围 为1~81yg/L，ICs。（50%抑制浓度）浮动范围为8-10yg/L;对20份样品进行检测，从标准 曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，W20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示 检测限，结果得该方法对玉米、甘薦的检测限为27yg/kg，灵敏度为1yg/kg。
[0052] 2、样本精密度和准确度试验 W回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差 (RSD%)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率（％)=实际测定值/理论值X100%，其 中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD% =SD/XX100%，其中SD为标准偏差，X为 测定数据的平均值。
[005引按50yg/kg、100yg/kg、150yg/kgS个浓度莽去津分别对玉米、甘薦样品进行 添加回收测定，每个样品做4个平行，用=批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及 精密度结果见下表。
表2甘薦精密度及准确度试验 CN105116139A 说明书 7/7 页
W50、100、150yg/kgS个浓度的莽去津分别对玉米、甘薦样品进行添加，平均回收率 在89. 5%-103. 4%之间；批内、批间相对标准偏差均小于10%。
[0055] 3、试剂盒稳定性试验 试剂盒保存条件为2~8°C，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50% 抑制浓度、莽去津添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正 常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试 剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20°C冰箱冷冻7 天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从W上结果可得出试剂盒可W在2~8°C至 少保存12个月W上。
【主权项】
1. 一种检测莠去津残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有偶联抗原的酶标 板、莠去津标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述莠去津偶联抗原是由莠去津半抗原与 载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋 白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述莠去津半抗原是由莠去津水解反应得 至1J，分子结构式为：4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述莠去津特异性抗体是以莠去津偶联抗 原作为免疫原制备获得，所述莠去津特异性抗体优选莠去津单克隆抗体。5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为所述洗涤液优选为pH值 7. 2-7. 5,含有 0? 8%-L0% 吐温-20、0. 03%。-0? 05%。叠氮化钠防腐剂、0? 1-0. 3mol/L的磷酸 盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。6. -种检测样品中莠去津含量的方法，包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行检测； (3) 检测结果分析。
【专利摘要】本发明提供了一种检测莠去津残留的酶联免疫试剂盒及其制备方法，它包括：酶标板、莠去津标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于快速检测玉米、甘蔗中莠去津残留的含量，具有检测快速、灵敏、特异性好、准确度高、检测成本低等特点，能够满足现场快速定性、定量检测的要求。
【IPC分类】G01N33/535
【公开号】CN105116139
【申请号】CN201510537865
【发明人】何方洋, 冯静, 谢体波, 刘红, 扶胜, 石洁, 詹洁, 陆苇, 罗贵昆
【申请人】贵州勤邦食品安全科学技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月28日