酮标准品与其它物质混合后制备的，甲卡西酮含量为51. 32wt% )，用瓶口移液器加入20mL 流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后用ImL移液器吸取上清液lmL，用瓶口移液器 加入IOmL流动相，振荡均匀后取I. 5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液；
[0050] (3)检测条件的设置：采用Agilent Zorbax? SB-Phenyl色谱柱，规格为 250mmX4. 6mm, 5 μπι，色谱条件：A-pH = 5. 0的4mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈=20:80,流速 I. 2mL/min，柱温 35°C，检测波长 254nm ;
[0051] (4)样品中甲卡西酮含量的测定，取样品溶液5yL进样检测；
[0052] (5)实验结果计算，利用外标法定量计算，即利用标准工作曲线，最终得到的待测 甲卡西酮样品中甲卡西酮的质量含量为：51. Olwt%。
[0053] 其中，流动相使用前经0. 45 μπι微孔过滤膜过滤后放入超声波清洗器中超声10~ 15miη，充分脱出流动相中的气体。
[0054] 实施例3
[0055] 本实施例与实施例1的区别在于样品及样品前处理过程不同：所用样品为甲卡西 酮含量为51. 32wt%的血液45mg，即取空白血液，添加甲卡西酮标准品；向样品中加入苯甲 醚、二氯甲烷和乙醚的混合溶液17mL，萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的 体积比为5:2:1. 5,向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15%的盐酸IOmL,除去有机 相后将剩余物置于35°C快速浓缩仪上浓缩至干，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡 10分钟，离心5分钟，离心后用ImL移液器吸取上清液lmL，加入约0.1 mg内标物质2-苯乙 胺，并用瓶口移液器加入IOmL流动相，振荡均匀后取I. 5mL装自动进样瓶，即得到样品溶 液。本实施例最终得到样品中甲卡西酮的质量含量为：50. 96wt%。
[0056] 实施例4
[0057] 本实施例与实施例2的区别在于样品及样品前处理过程不同：所用样品为甲卡西 酮含量为51. 32wt%的血液，即取空白血液，添加甲卡西酮标准品。向样品中加入苯甲醚、二 氯甲烷和乙醚的混合溶液17mL，萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比 为5:2:1. 5,向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15%的盐酸IOmL,除去有机相后将 剩余物置于35°C快速浓缩仪上浓缩至干，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡10分 钟，离心5分钟，离心后用ImL移液器吸取上清液lmL，用瓶口移液器加入IOmL流动相，振荡 均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液。本实施例最终得到样品中甲卡西酮的质 量含量为：50. 44wt%。
[0058] 验证例1
[0059] (1)选择2-苯乙胺作为内标物质的过程。
[0060] 配制浓度分别为0. lmg/mL的甲卡西酮和0. lmg/mL的内标溶液，采用实施例中的 色谱条件，获得的液相色谱图如图2所示，可见两者有较好的分离度。
[0061] (2)内标工作曲线的建立
[0062] 实验方法：取甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0. lmg/mL的内标溶液依次稀 释成质量浓度分别为〇. 5、0. 1、0. 05、0. 01、0. 005、0. 001、0. 0005mg/mL的系列标准溶液，并 保持内标溶液的浓度均为〇. 01mg/mL。分别取不同浓度的标准液5 μ L进样，记录响应的峰 面积。每个浓度进样3次，并对3次峰面积比值的平均值A及质量浓度比值c (mg/mL)进行 线性回归。
[0063] 实验结果表明，甲卡西酮的线性范围为0. 005-0. 5mg/mL，线性方程为A = 0. 6664c-0. 0172, R2 = 1，图3为甲卡西酮的内标工作曲线。
[0064] 验证例2
[0065] 外标工作曲线的建立
[0066] 取甲卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为0. 5、0. 1、0. 05、0. 01、 0. 005、0. 001、0. 0005mg/mL的系列标准溶液。分别取不同浓度的标准液5 μ L进样，记录响 应的峰面积。每个浓度进样3次，并对3次峰面积的平均值A及质量浓度c (mg/mL)进行线 性回归。
[0067] 实验结果表明，甲卡西酮的线性范围为0. 005-0. 5mg/mL，线性方程为A = 6X106c+11143, R2= 0· 9999,检出限为 0· 2 yg/mL(S/N 彡 3)。
[0068] 比较例
[0069] 考察现有技术中酸性改性剂对实验结果的影响
[0070] (1)考察磷酸对实验结果的影响
[0071] 流动相：Α-0· 5 %磷酸水溶液；B-乙腈。
[0072] 结论：用磷酸做流动相，随着有机相比例降低，拖尾严重，和麻黄碱分得不好。
[0073] (2)考察乙酸对实验结果的影响
[0074] 流动相：Α-0· 5 %乙酸水溶液；B-乙腈。
[0075] 结论：甲卡西酮的峰形较好，但和麻黄碱不能分开。
[0076] (3)考察三氟乙酸对实验结果的影响
[0077] 流动相：Α-三氟乙酸（pH = 3. 5)的水溶液；B-乙腈。
[0078] 结论：用三氟乙酸（pH = 3. 5)的水溶液做流动相，低流速时得到较好的峰形，但理 论塔板数较低；高流速时变成双峰。
[0079] 可见，现有的酸性改性剂无法满足高流速、高理论塔板数、峰形好的检测要求。
[0080] 检测条件的优化选择实验
[0081] 1. 1甲卡西酮的紫外吸收光谱
[0082] 从图4中可见，甲卡西酮的最大吸收波长为254nm，因此选择254nm做为主定量波 长。由于其只有一个吸收峰，因此不存在辅定量波长。
[0083] 1. 2液相条件的选择
[0084] 仪器：岛津超快速液相色谱（UFLC)仪，包括LC-20AD型栗、SIL-20AC型进样器、 SPD-M20A型检测器、CTD-20AC型柱温箱、数据处理软件LC solution。
[0085] 1. 2. 1考察醇、水系统对实验结果的影响
[0086] 色谱条件：XR-〇DS 色谱柱（75mmX2. 0mm，2. 2 μπι);柱温：35°C ;检测波长 254nm ; 流动相：水-甲醇（90:10)，流速0· 2mL/min ;进样量：10 μ L。
[0087] 结论：从图5中可见，醇、水系统不适合甲卡西酮的分析，峰形呈巨大的馒头峰。
[0088] 1. 2. 2考察不同种类的酸对实验结果的影响
[0089] 色谱条件：XR-〇DS 色谱柱（75mmX 2. 0mm，2. 2 μ m);柱温：35°C ;检测波长 254nm〇
[0090] 考察酸的种类包括甲酸和三氟乙酸。
[0091] 1. 2. 2. 1考察不同甲酸比例对实验结果的影响
[0092] 流动相：A-0. 1 %甲酸水溶液；B-乙腈
[0093] 表1.不同流动相比例对实验结果的影响
[0094] CN 105181823 A 说明书 6/22 页
[0096] 结论：变换几种流动相比例，实验结果均不理想，峰形不好，且保留时间过短。
[0097] 1. 2. 2. 2考察不同pH值甲酸对实验结果的影响
[0098] (I)pH = 3的甲酸溶液对实验结果的影响
[0099] 流动相：A-pH = 3的甲酸水溶液；B-乙腈。
[0100] 表2.不同流动相比例对实验结果的影响
[0102] 结论：峰形不好，保留时间太短。
[0103] (2)pH = 3. 5的甲酸溶液对实验结果的影响
[0104] 流动相：A-pH = 3. 5的甲酸水溶液，B-乙腈，A:B = 95:5。
[0105] 结论：如图6所示，色谱峰拖尾，出峰时间太快，在溶剂峰前出峰。
[0106] (3)pH = 4的甲酸溶液对实验结果的影响
[0107] 流动相：A-pH = 4的甲酸水溶液，B-乙腈，A:B = 95:5。
[0108] 结论：如图7所示，色谱峰拖尾，出峰时间太快，在溶剂峰前出峰。
[0109] (4)pH = 4. 5的甲酸溶液对实验结果的影响
[0110] 流动相：Α_ρΗ = 4. 5的甲酸水溶液，B-乙腈。
[0111] 表3.不同流动相比例对实验结果的影响
CN 105181823 A 说明书 7/22 页
[0114] 结论：流动相的酸性越弱，甲卡西酮的保留时间越短，峰形均有拖尾。
[0115] 1. 2. 2. 2考察