以通 过免疫测定测量的血浆中的PSA包括游离PSA(fPSA)和游离PSA(fPSA)与α1-抗胰凝乳 蛋白酶的复合物（PSA-ACT)。
[0038] 目标样品没有特别限制，只要该样品包括PSA，但优选为血液、血清、血浆等。
[0039](抗PSA单克隆抗体）
[0040] 使用能与fPSA和PSA-ACT二者均反应且识别不同表位的至少两种类型的抗PSA 单克隆抗体作为针对PSA的单克隆抗体。所述两种类型的抗PSA单克隆抗体之间表位的不 同可以通过证实是否能使用PSA(抗原）和这些抗体进行常规的夹心免疫测定来确定。
[0041](抗体的选择）
[0042] 抗体的选择如下所述。
[0043] 理想的是选择在ELISA等中与PSA-ACT和fPSA有高反应性（即高效价）的抗体。 理想地是选择能确保足够测量灵敏度的载体。在载体上固定化从所挑选的具有高效价的抗 体中任意选择的两种抗体，选择抗体的组合使得与PSA-ACT和fPSA的反应性显示小的差异 并获得足够的测量灵敏度。
[0044] 优选抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数（fKd)与对游离PSA和α1-抗胰 凝乳蛋白酶的复合物（PSA-ACT)的解离常数（cKd)的比值（fKd/cKd)为大于0. 1，更优选大 于0. 2。比值（fKd/cKd)的上限优选为2. 0或更小，更优选为1. 5或更小。对游离PSA的解 离常数（fKd)优选为10nM或更小，更优选为6nM或更小。
[0045] 单克隆抗体可以包括，例如，由木瓜蛋白酶等部分水解获得的Fab片段，由胃蛋白 酶等部分水解获得的F(ab'）2片段，和/或F(ab'）2片段经还原获得的Fab'片段。
[0046](不溶载体）
[0047] 其上固定化了抗体的不溶载体没有特别限制，但优选选自包含衍生于以下的物质 的颗粒：合成聚合物的乳胶颗粒、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷、和/或 磁性体。合成聚合物优选是选自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚 物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯 共聚物的一种或多种合成聚合物。
[0048] 特别优选使用通过无皂乳液聚合获得的聚苯乙烯乳胶颗粒。聚苯乙烯乳胶可以例 如用W02003/005031中公开的方法生产。特别地，在包含水作为溶剂的反应容器中装入特 定量的苯乙稀单体、引发剂（如过硫酸钾）、和聚合稳定剂（如苯乙稀磺酸钠）。在任选地 加入乳化剂（如，十二烷基硫酸钠）后，将混合物在氮气气氛中加热并搅拌，进行聚合。
[0049](不溶载体的粒度）
[0050] 不溶载体的平均粒度为大于0. 20μm且等于或小于0. 40μm，优选大于0. 22μm且 等于或小于〇· 40μm，更优选为等于或大于0· 23μm且等于或小于0· 40μm，更优选为等于 或大于0. 23且等于或小于0. 34μm。如果不溶载体的平均粒度为0. 20μm或更小，或者超 过0.40μπι，则可能难以获得等摩尔反应。应注意，本文中与不溶载体一起使用的术语"平 均粒度（μπι)"指使用透射式电子显微镜（参见实施例）进行图像分析并四舍五入至小数 点后两位数字获得的值。应注意，通过图像分析可以将平均粒度计算到小数点后四位数字。
[0051] 在平均粒度大于0. 20μm且等于或小于0. 40μm的情况下，当颗粒Α的平均粒度 (土SD)为M±N，颗粒B的平均粒度（土SD)为P±Q，M>P，且N和Q为0. 02μπι或更小时， 如果这两种类型的颗粒（例如在不同批次中制备的）满足"Μ-Ν彡P+Q"的关系，则认为这 两种类型的颗粒具有相同的平均粒度。
[0052] 例如，当颗粒Α的平均粒度为0. 22±0. 02μm，且颗粒Β的平均粒度为 0. 21 ±0. 02μm时，M-N为0. 20,P+Q为0. 23 (即满足上述关系）。因此，认为颗粒A和颗粒 B具有相同的平均粒度。
[0053] 当颗粒A的平均粒度为0. 40±0. 02μπι，且颗粒B的平均粒度为0. 37±0. 02μπι 时，Μ-Ν为0. 38,P+Q为0. 39 (即满足上述关系）。因此，认为颗粒Α和颗粒Β具有相同的平 均粒度。
[0054] 如上所述被认为具有相同的平均粒度并以任意比例混合的颗粒的混合物在本发 明的范围内。
[0055] 根据本发明的实施方案，两种或更多种载体具有相同的平均尺寸，但不排除由不 同材料制成的载体的组合。也不排除具有不同平均粒度的载体的组合，只要其中的载体具 有在上述范围内的平均粒度并用于主要反应中以获得等摩尔反应。
[0056](抗体的固定化）
[0057] 不溶载体可以通过常用的物理吸附法，和化学结合法，免疫结合法等在其上固定 化抗体。其上分别固定化了识别不同表位的两种类型的单克隆抗体的载体通常以适当的比 例混合（参见实施例），但是可以将所述两种类型的单克隆抗体事先以适当的比例混合以 固定化在载体上。
[0058](凝集促进剂）
[0059] 凝集促进剂没有特别限制，只要所述凝集促进剂促进其上固定化了抗体的不溶载 体经由抗原抗体反应发生的凝集。凝集促进剂的实例包括聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷 酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、聚（2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱）（以下可称为"MPC 聚合物"）等。多糖优选是选自右旋糖酐、普鲁兰、和烷基化多糖（包括甲基纤维素和乙基 纤维素）的一种或多种多糖。聚-γ-谷氨酸可以是碱金属盐（如钠盐、钾盐、或锂盐），碱 土金属盐（如镁盐、钙盐、或钡盐），或铵盐。
[0060] 其中，优选聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，更优选聚乙二醇。应注意可以组合使用多 个凝集促进剂。
[0061] 市场上可以买到不同分子量的产品作为凝集促进剂，可以在考虑水溶性等的情 况下进行适当的选择。例如，聚乙二醇的数均分子量优选为3, 000-1，000, 000,更优选为 5, 000-100, 000,特别优选为5, 000-50, 000。当聚乙二醇的数均分子量为3, 000-1，000, 000 时，可以获得极好的测量灵敏度。聚乙烯吡咯烷酮可以具有例如25, 000-1，200, 000的重均 分子量，优选40, 000-360, 000。聚-γ-谷氨酸可以具有例如200, 000-6, 000, 000的重均分 子量。MPC聚合物可以具有例如5, 000-5, 000, 000的分子量，优选500, 000-2, 000, 000。
[0062] 在考虑载体的平均粒度和凝集促进剂的类型的情况下，优选适当地设定凝集促 进剂的浓度以获得等摩尔反应。例如，当凝集促进剂与样品相接触时，优选调节凝集促 进剂的浓度以使凝集促进剂的终浓度为〇.l_5wt%，更优选为0. 2_2wt%，特别优选为 0. 2-0. 6wt%。当凝集促进剂的终浓度为0.l-5wt%时，可以获得极好的测量灵敏度。
[0063](添加剂）
[0064] 可以向试剂中加入多糖（如葡萄糖和蔗糖）、无机盐（如氯化钠）、表面活性剂（如 聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯）、防腐剂（如叠氮化钠）、和/或非特异性反应抑制剂（如 来自于正常动物的IgG抗体），只要其不妨碍抗PSA单克隆抗体和PSA之间的反应。
[0065] 试剂中多糖的含量优选为大约0. 1至大约10wt%，试剂中无机盐的含量优选为大 约0.01至大约5wt%，试剂中表面活性剂的含量优选为大约0.02至大约5wt%，试剂中防 腐剂的含量优选为大约0.001至大约0.lwt%，试剂中非特异性反应抑制剂的含量优选为 大约0. 001至大约5wt%。
[0066] (缓冲液）
[0067] 根据本发明实施方案的抗原-抗体反应在缓冲液中进行。缓冲液的类型、浓度和 pH没有特别限制，只要能发生抗原-抗体反应。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good's缓冲液等。缓冲液的浓度为大约3至大 约500mM，优选为5-100mM，更优选为5-50mM。优选缓冲液具有中性至碱性的pH(通常为 6. 5-9· 5)〇
[0068] (凝集信号测定方法）
[0069] 可以使用用于测定凝集反应的任何方法测定凝集信号。例如，可以通过测量吸光 度、颗粒计数、颗粒大小、散射光等测定凝集信号。
[0070] 例如，如下所述测定PSA。
[0071] 特别地，当用能与fPSA和PSA-ACT二者反应的至少两种类型的抗体固定化在载体 (如乳胶）上并随后与包括fPSA和/或PSA-ACT的样品反应时，发生凝集反应。样品中的 PSA总水平可以通过测定凝集程度，并将所测定的凝集程度与使用具有已知PSA水平的标 准溶液时的凝集程度相比较来确定。例如，优选使用通用的生物化学自动分析仪，通过吸光 度的变化来测定凝集程度。在这种情况下，优选使用500-900nm波长的吸光度的变化来测 定凝集程度。
[0072] (等摩尔反应）
[0073] 由于可以使用根据本发明实施方案的测定获得对fPSA和PSA-ACT的等摩尔反应， 所以可以高精度地定量测定PSA。
[0074] 本文使用的表述"对fPSA和PSA-ACT的等摩尔反应"指测定仅包括fPSA的样品获 得的信号与测定仅包括PSA-ACT(与fPSA等摩尔）的样品获得的信号的比值为大约1 : 1。
[0075] 例如，计算每等摩尔的fPSA和PSA-ACT