的凝集信号的比值（PSA-ACT/fPSA)(以下 可称为"c/f比值"），当c/f比值为85-115% (更优选90-110% )时则视为获得等摩尔反 应。
[0076] (生产试剂的方法）
[0077] 如下所述生产根据本发明实施方案的PSA测定试剂。
[0078] 特别地，可以如下生产PSA测定试剂：提供其上已经固定化了能与PSA-ACT和 fPSA二者反应且识别位点不同的两种类型的抗体的载体，将其上已经固定化了两种类型的 抗体且具有相同平均粒度（大于0.20μπι且等于或小于0.40μπι)的载体的混合比设定在 特定范围内，并调节凝集促进剂的浓度使得获得对PSA-ACT和fPSA的等摩尔反应。混合比 为1 : 10至10 : 1，优选为1 : 5至5 : 1，更优选为1 : 2至2 : 1。
[0079] 下面进一步通过实施例描述本发明。应当注意本发明不限于下述实施例。
[0080] 实施例
[0081] (单克隆抗体的制备）
[0082] 1.免疫
[0083] (1)免疫原
[0084] 使用来源于人精液的纯化的PSA(SCIPACLtd，编号P117-7,纯度：96% )作为免 疫原。纯化的PSA用20mMPBS(pH:7. 2)渗析后使用。
[0085] (2)免疫方法
[0086] 将上述PSA溶液和完全弗氏佐剂（CFA) (GIBC0)以1:1的比例混合并乳化，对6 周龄的雌性Balb/C小鼠的背部以25ygPSA/小鼠的量进行皮下施用。以2周的间隔进行 另外的三次免疫，在细胞融合前3天将PSA溶液（25μgPSA/小鼠）进行腹膜内施用。
[0087] 2.细胞融合
[0088] 从用PSA免疫的每只小鼠中摘除脾脏，收集脾细胞。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细 胞SP2/0_Agl4以6 : 1的比例混合，在存在50%聚乙二醇1540(WakoPureChemical InduStries，Ltd.)的条件下融合。将融合细胞悬浮于HAT培养基中，使得脾细胞的数量为 2. 5X106,并使其以0. 2ml/孔的量分散于96孔培养板（CORNINGInc.)上。在5% 0)2培 养箱中在37°C培养融合细胞2周。
[0089] 3.筛选
[0090] 将分散有融合细胞的培养板的每个孔中的培养上清液进行ELISA(见下文）以选 择与fPSA和PSA-ACT二者均反应的孔。
[0091] ⑴材料：抗原
[0092] 1)PSA:SCIPAC，编号P117-7
[0093] 2)PSA-ACT:SCIPAC，编号P192-3
[0094](2)方法
[0095] 1)将ELISA板（Nunc)用山羊抗鼠IgG(Fc)抗体（Jackson Inc. )(5μg/ml)包被 (50以1/孔），于4°(：放置过夜。
[0096] 2)在将ELISA板用洗涤液（0· 05%Tween20-PBS)洗涤三次（400μ1/孔）后，将 封闭试剂（0.05%Tween20-PBS)以200μ1/孔的量分散于每孔中，将ELISA在室温放置1 小时。
[0097] 3)除去封闭试剂后，将分散有融合细胞的培养板的每个孔中的培养上清液以 50μ1/孔的量分散于ELISA板的每个孔中，将ELISA板在室温放置1小时。
[0098] 4)将ELISA板用洗涤液（0· 05%Tween20-PBS)洗涤 3 次后，将用 0· 05%Tween 20-PBS稀释至5ng/ml的fPSA或PSA-ACT以50μ1/孔的量分散于每个孔中，将ELISA板在 室温放置1小时。
[0099] 5)将ELISA板用洗涤液洗涤3次后，将HRP-兔抗人PSA抗体（X500)以50μ1/ 孔的量分散于每个孔中，将ELISA板在室温放置1小时。应注意使用兔抗人PSA抗体（DAK0) 和过氧化物酶（ToyoboCo.，Ltd.)通过过碘酸法制备HRP-兔抗人PSA抗体。
[0100] 6)将ELISA板洗涤3次后，将0PD显色剂以50 μ 1/孔的量分散于每个孔中，将 ELISA板在室温放置10分钟。
[0101] 7)将终止液（1. 5N硫酸）以50μ1/孔的量分散于每个孔中以终止反应，用平板读 数器（plateleader)测定492nm波长下的吸光度。
[0102] 4.克隆
[0103] 将上述筛选过程中与fPSA和PSA-ACT二者均反应的孔中的细胞系通过有限稀释 法进行克隆以建立杂交瘤。由此获得28种建立的杂交瘤。
[0104] 5.单克隆抗体的制备
[0105] 将通过克隆获得的杂交瘤（0.5X106细胞）对2周前已进行0.5ml降植烷腹 膜内施用的8周龄的雌性Balb/C小鼠进行腹膜内施用。2周后收集腹膜液，用蛋白A柱 (Amersham pic)纯化IgG级分。由此获得28种单克隆抗体的纯化级分。
[0106](对单克隆抗体组合的初步考虑）
[0107] 将28种类型的单克隆抗体中的每一种固定化在乳胶上，如下所述观察乳胶的凝 集。两种抗体（#91抗体和#51抗体）表现出大信号，选择其与乳胶的组合。
[0108] 1.抗体的选择
[0109] (1)将用20mMTris-HCl (pH :8· 5)稀释的1%乳胶（0·3μπι)溶液与每种单克隆抗 体溶液（〇.5Abs)按1:1(v/v)的比例混合，在4°C搅拌混合物2小时。
[0110] (2)加入包括 0· 4%BSA(2vol)的 20mMTris-HCl(pH:8· 5)后，在 4°C搅拌混合物 1小时。
[0111] (3)离心去除上清液，悬于5mMMOPS(pH:7· 0)中，使得600nm的吸光度为2Abs。
[0112](4)选择两种MoAb-Lx(抗体固定化的乳胶），按1 : 1 (v/v)的比例混合以获得试 剂2 (用所有的组合制备试剂2)。
[0113] (5)利用试剂 1(包括0·1%BSA、0. 5MNaCl、0. 3%聚乙烯吡咯烷酮K-90(PVPK-90) 的30mMHEPES缓冲液（pH:7. 0))和试剂2,使用Hitachi7170自动分析仪测定26ng/ml的 fPSA和PSA-ACT。
[0114](6)从表现出凝集反应的单克隆的抗体组合中获得被认为识别不同表位的两组抗 体。
[0115]i) #63217、#63251、和 #63279
[0116]ii)#63214和#63291
[0117] 使用i)和ii)组的抗体组合观察到凝集反应。
[0118] 产生抗体#63251、#63279、和#63291的杂交瘤保藏于国际专利生物保藏机构 (IP0D)，独立行政法人产业技术综合研究所，保藏号为FERMBP-11453、FERMBP-11454、和 FERMBP-11455。从这些杂交瘤获得的单克隆抗体可称为"#51抗体"、"#79抗体"、和"#91 抗体"，分别对应于识别号码的最后两位数字。
[0119](不同粒度的乳胶的产生）
[0120] 1)0. 2μπι或更小
[0121] 在配备有搅拌器、回流冷凝器、温度计、氮入口管、加热油浴等的玻璃反应容器 (21)中加入1200g水、200g苯乙烯单体、1. 2g过硫酸钾、和0. 2g苯乙烯磺酸钠，在搅拌下 (大约200rpm)将反应容器中的气氛充分置换为氮气。将单体在70°C聚合约18小时后，通 过滤纸（ADVANTECNo.
[0122] 2)过滤反应溶液，获得乳胶颗粒。用透射式电子显微镜对乳胶颗粒进行照相，任意 选择3个视野，对每个视野内的100个或更多个乳胶颗粒进行图像分析以确定每个视野的 乳胶颗粒的平均粒度（土SD)，并取每个视野的乳胶颗粒平均粒度（土SD)的平均值，从而确 定乳胶颗粒的平均粒度（土SD)。由此确定的平均粒度为0. 19μm(±0. 01μm)。
[0123] 2-1)0. 23 μ m
[0124] 用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯 乙烯单体、2. 4g过硫酸钾、和0.lg苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为 0. 23μm(±0. 01μm)。
[0125] 2-2)0. 25μm
[0126] 用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯 乙烯单体、0.9g过硫酸钾、和0.2g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为 0. 25μm(±0. 01μm)。
[0127] 2-3)0. 29μm
[0128] 用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯 乙烯单体、1.3g过硫酸钾、和0.lg苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为 0. 29μm(±0. 01μm)。
[0129] 2-4)0. 34μm
[0130] 用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯 乙烯单体、1. 3g过硫酸钾、和0. 08g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为 0. 34μm(±0. 01μm)。
[0131] 2-5)0. 40μm
[0132] 用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯 乙烯单体