一种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及中药技术领域，更具体地说设及一种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析 方法。
【背景技术】
[0002] 中药治疗疾病已经有几千年的历史了，随着科学技术的发展，中药也面临着现代 化，要走上世界市场，运就要求必须做好中药质量的控制，中药的成分含量的质量控制则是 最关键的，尤其是对于复方的中药制剂，要想全面的控制中药的质量，必须做好各成分的含 量的精确测定。
[0003] 生肌膏出自张山雷《瘍科纲要》，是中医外科常用药，由象皮、炉甘石、龟甲、血余、 当归、生地等药材经麻油高溫熬制而成，具有生肌、敛疮功效，用于治疗创伤合并感染、压迫 性溃瘍、糖尿病、下肢静脉溃瘍、烧烫伤等所致慢性创面疗效显著。营养因素在创面愈合中 发挥着重要的作用。有效的能量支持能为机体修复创伤提供充足的能量和营养物质，减少 机体自身蛋白的降解，增强机体免疫力，促进创面的功能愈合。能量、碳水化合物、蛋白质、 脂肪、维生素及矿物质代谢都影响着创面愈合的进程。蛋白质是影响创面愈合最重要的因 素之一。蛋白质缺乏将导致毛细血管形成、成纤维细胞增殖、蛋白多糖合成、胶原合成及伤 口重塑等方面的障碍。蛋白质的缺乏也会影响到免疫系统，表现在白细胞吞隧作用的减弱 及感染机会增加。生肌膏中丰富的氨基酸在促进创面愈合中发挥着重要的作用。由于剂型 原因，该制剂质量控制一直缺乏有效的标准，确定该标准则需要在测定各成分含量时，必须 能除去干扰因素，精确的测定含量，做到效的控制药物质量，保证药物的安全。
【发明内容】
[0004] 本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方 法。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案予W实现。
[0006] -种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方法，生肌膏包含下列重量组份的原料药： 象皮15-20份，当归10-15份，血余10-15份，生地20-30份，龟甲20-30份，麻油400-500份，炉 甘石28-32份，生石膏25-30份W及蜂蜡80-100份，按照下述方法进行测定：
[0007] 步骤1，供试品溶液的制备:取生肌膏置于锥形瓶中，水浴加热使其烙化，向锥形瓶 中加入热水，充分揽拌，静置冷却后置于冰箱冷冻，待凝固后，取水层冷冻层，烙化，过滤，滤 渣用无水乙醇洗涂后，干燥后得干燥物，取干燥物置于安飯中，向安飯中加入6mol/L盐酸溶 液，ll〇°C水解，放置至室溫，过滤至50mL量瓶中，过滤剩余的残渣用纯化水反复冲洗，加纯 化水至刻度，摇匀，量取50mL量瓶中的溶液，蒸干，用0.1mol/L盐酸溶液转移至IOmL量瓶中， 定容，摇匀，即得供试品溶液；
[000引步骤2，空白样品溶液的制备:按照当归10-15份，血余10-15份，生地20-30份，龟甲 20-30份，麻油400-500份，炉甘石28-32份，生石膏25-30份W及蜂蜡80-100份，将炉甘石、石 膏粉碎成极细粉，过筛备用，当归、龟甲、血余、生地与麻油同置锅内炸枯，去渣，滤过，将蜂 蜡完全烙化后滤入热油内，离火降溫，加入炉甘石粉及石膏粉，不断揽拌至冷却成膏，即得 空白样品，取空白样品置于锥形瓶中，水浴加热使其烙化，向锥形瓶中加入热水，充分揽拌， 静置冷却后置于冰箱冷冻，待凝固后，取水层冷冻层，烙化，过滤，滤渣用无水乙醇洗涂后， 干燥后得干燥物，取干燥物置于安飯中，向安飯中加入6mol/L盐酸溶液，110°C水解，放置至 室溫，过滤至50mL量瓶中，过滤剩余的残渣用纯化水反复冲洗，加纯化水至刻度，摇匀，量取 50mL量瓶中的溶液，蒸干，用O.lmol/L盐酸溶液转移至IOmL量瓶中，定容，摇匀，即得空白样 品溶液；
[0009] 步骤3,对照品溶液的制备:称取天冬氨酸、谷氨酸、L-径脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、 组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、鄉氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯 丙氨酸、赖氨酸等17种氨基酸对照品于量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液制成对照品溶液；
[0010] 步骤4,溶液的衍生化:将供试品溶液、空白样品溶液W及对照品溶液分别置于离 屯、管中，依次加 Imol/LS乙胺的乙腊溶液和O.lmol/L异硫氯酸苯醋(PITC)的乙腊溶液，縱 满混合一段时间后，室溫放置，再向其中加入正已烧，縱满混合一段时间W后，放置，取下层 溶液，再向下层溶液中加入正已烧，振摇，放置，取放置W后的下层溶液，微孔过滤后，即得 经衍生化的供试品溶液、经衍生化的空白样品溶液W及经衍生化的对照品溶液；
[0011] 步骤5，色谱测定:色谱条件为色谱柱采用长度为250mm，内径为4.6mm，进样颗粒大 小为扣m，流动相A为乙腊-0.1 mo 1/L醋酸钢溶液，流动相B为乙腊-水，进行梯度洗脱，体积流 量ImL/min，检测波长254nm，柱溫40°C，进样量!5化。
[0012] 在所述步骤1中，取生肌膏30-50g置于锥形瓶中，水浴加热使其烙化，向锥形瓶中 加入热水30-50mL，充分揽拌，静置冷却后置于冰箱冷冻2-4h，待凝固后，取水层冷冻层，烙 化，过滤，滤渣用无水乙醇洗涂2-4次后，干燥后得干燥物，取干燥物0.1-0.5g置于安飯中， 向安飯中加入6mol/L盐酸溶液4-8mL，110°C水解10-1地，放置至室溫，过滤至50mL量瓶中， 过滤剩余的残渣用纯化水反复冲洗2-4次，加纯化水至刻度，摇匀，量取50mL量瓶中的溶液 3-8mL，蒸干，用O.lmol/L盐酸溶液转移至IOmL量瓶中，定容，摇匀，即得供试品溶液。
[001引在所述步骤帥，按照当归10-15份，血余10-15份，生地20-30份，龟甲20-30份，麻 油400-500份，炉甘石28-32份，生石膏25-30份W及蜂蜡80-100份，将炉甘石、石膏粉碎成极 细粉，过筛备用，当归、龟甲、血余、生地与麻油同置锅内炸枯，去渣，滤过，将蜂蜡完全烙化 后滤入热油内，离火降溫，加入炉甘石粉及石膏粉，不断揽拌至冷却成膏，即得空白样品，取 空白样品30-50g置于锥形瓶中，水浴加热使其烙化，向锥形瓶中加入热水30-50mL，充分揽 拌，静置冷却后置于冰箱冷冻2-4h，待凝固后，取水层冷冻层，烙化，过滤，滤渣用无水乙醇 洗涂2-4次后，干燥后得干燥物，取干燥物0.1-0.5g置于安飯中，向安飯中加入6mol/L盐酸 溶液4-8mL，110°C水解10-1地，放置至室溫，过滤至50mL量瓶中，过滤剩余的残渣用纯化水 反复冲洗2-4次，加纯化水至刻度，摇匀，量取50mL量瓶中的溶液3-8mL，蒸干，用0.1mol/L盐 酸溶液转移至IOmL量瓶中，定容，摇匀，即得空白样品溶液。
[0014]在所述步骤3中，称取天冬氨酸、谷氨酸、L-径脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏 氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、鄉氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖 氨酸等17种氨基酸对照品于量瓶中，加 O.lmol/L盐酸溶液制成每ImL分别含天冬氨酸43iig、 谷氨酸12化脯氨酸84yg、丝氨酸44yg、甘氨酸210yg、组氨酸29yg、苏氨酸10化g、丙氨 酸56yg、精氨酸75yg、脯氨酸10化g、酪氨酸66yg、鄉氨酸7祉g、甲硫氨酸60yg、异亮氨酸43y g、亮氨酸7 7yg、苯丙氨酸9 Iyg、赖氨酸10化g的对照品溶液。
[0015] 在所述步骤4中，将供试品溶液、空白样品溶液W及对照品溶液各5-15mL分别置于 离屯、管中，依次加 Imol/LS乙胺的乙腊溶液0.5-1.5mL和0.1mol/L异硫氯酸苯醋（PITC)的 乙腊溶液0.5-1.5mL，縱满混合3-7min后，室溫放置40-80min，再向其中加入正已烧3-5mL， 縱满混合3-7min后，放置5-15min，取下层溶液，再向下层溶液中加入正已烧3-5mL，振摇，放 置5-15min，取放置W后的下层溶液，微孔过滤后，微孔过滤所采用的微孔滤膜的孔径为 0.3-0.5WH，即得经衍生化的供试品溶液、经衍生化的空白样品溶液W及经衍生化的对照品 溶液。
[0016] 在所述步骤5中，色谱条件为Hypersil 0DS-2打8色谱柱，色谱柱采用长度为250mm， 内径为4.6mm，进样颗粒大小为扣m，流动相A为乙腊-0.1mol/L醋酸钢溶液，其中乙腊-0.1mol/L醋酸钢溶液的PH为6.0-7.0，乙腊与0.1mol/L醋酸钢溶液的配比为a-5):(95-100)，流动相B为乙腊-水，其中乙腊与水的配比为(3-5) :(0.5-2),进行梯度洗脱，体积流量 ImL/min，检测波长254nm，柱溫40°C，进样量!5化。
[0017] 本发明的有益效果为:采用高效液相色谱法，建立生肌膏氨基酸的HPlX指纹图谱， 并对10批生肌膏进行研究，建立了生肌膏氨基酸HPlX指纹图谱共用模式，其精密度、稳定 性、重复性符合中药指纹图谱相关技术参数要求。同时指认了 18个共有峰，并对指纹图谱中 各特征峰进行氨基酸定性鉴别，共鉴定17个氨基酸成分。对10批生肌膏氨基酸进行相似度 评价，结果均大于0.9,表明生肌膏氨基酸成分稳定，此方法对于生肌膏的质量控制提供依 据。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明中经衍生化的供试品溶液、经衍生化的空白样品溶液W及经衍生化 的对照品溶液的高效液相色谱图，其中A为经衍生化的空白样品溶液，B为经衍生化的对照 品溶液，C为经衍生化的供试品溶液；
[0019] 图2是本发明中各个实施例中经衍生化的供试品溶液的高效液相色谱图，其中，1 为实施例1的高效液相色谱图，2为实施例2的高效液相色谱图，3为实施例3的高效液相色谱 图，4为实施例4的高效液相色谱图，5为实施例5的高效液相色谱图，6为实施例6的高效液相 色谱图，7为实施例7的高效液相色谱图，8为实施例8的高效液相色谱图，9为实施例9的高效 液相色谱图，10为实施例10的高效液相色谱图，11为对照图谱；
[0020] 图3是本发明所得的生肌膏氨基酸指纹图谱。
【具体实施方式】
[0021 ]下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0022] 实验过程中所采用的仪器与试剂，如下所示：
[0023]
[0025] 实施例1
[00%] -种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方法，生肌膏包含下列重量组份的原料药： 象皮15份，当归10份，血余10份，生地20份，龟甲20份，麻油400份，炉甘石28份，生石膏25份 W及蜂蜡80份，按照下述方法进行测定：
[0027]步骤1，供试品溶液的制备：取生肌膏30g置于锥形瓶中，水浴加热使其烙化，向锥 形瓶中加入热水30mL，充分揽拌，静置冷却后置于冰箱冷冻化，待凝固后，取水层冷冻层，烙 化，过滤，滤渣用无水乙醇洗涂2次后，干燥后得干燥物，取干燥物0.1 g置于安飯中，向安飯 中加入6mol/L盐酸溶液4血，110°C水解IOh，放置至室溫，过滤至50血量瓶中，过滤剩余的残 渣用纯化水反复冲洗2次，加纯化水至刻度，摇匀，量取50mL量瓶中的溶液3mL，蒸干，用 0.1mol/L盐酸溶液转移至IOmL量瓶中，定容，摇匀，即得供试品溶液；
[002引步骤2,空白样品溶液的制备:按照当归10份，血余10份，生地20份，龟甲20份，麻油 400份，炉甘石28份，生石膏25份W及蜂蜡80份，将炉甘石、石膏粉碎成极细粉，过筛备用，当 归、龟甲、血余、生地与麻油同置锅内炸枯，去渣，滤过，将蜂蜡完全烙化