二氧化锰薄片模拟酶传感器以及制备方法和t4pnk的检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及模拟酶传感器，具体地，涉及一种二氧化锰薄片模拟酶传感器以及制备方法和T4PNK的检测方法。
【背景技术】
[0002]T4多核苷酸激酶(PNK)，一种5’激酶，自从它1965在大肠杆菌蛋白提取物感染偶数噬菌体第一次被发现，到目前为止，已成为最常用的分子生物学酶。它可以催化γ-三磷酸腺苷(ATP)的磷酸盐残留量5’末端的核苷酸或核苷酸的5。羟基轴承。这对细胞核酸代谢是非常重要的，特别是在细胞对DNA损伤的反应，这与许多人类疾病，如沃纳综合征，Bloom综合征和1?01:111111111(1-1'1101118011-1'1101118011综合征等都有着密切联系。14?爾也被广泛应用于检测DNA加合物或寡核苷酸和DNA损伤修复。因此，一个敏感的，精确的用于检测Τ4ΡΝΚ活性的和检测其潜在抑制剂的实验方法的发展是十分有必要的。
[0003]传统的方法介绍了磷酸化检测和DNA激酶活性测定，包括活泼的同位素32P标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，放射自显影、荧光等方法。然而，这些方法都有着不同程度上的费时，费力，不敏感，或要求放射性标记底物的缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种二氧化锰薄片模拟酶传感器以及制备方法和T4PNK的检测方法，该制备方法操作简单，同时制得的传感器对于T4PNK的检测具有灵敏度高、检测限低和操作简单的特点。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供了一种二氧化锰薄片模拟酶传感器的制备方法，包括:
[0006]I)将MnO2纳米片溶液与TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0007]2)将发夹DNA溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)与λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0008]3)将MnO2-TMB混合溶液与DNA溶液混合以制得二氧化锰薄片模拟酶传感器。
[0009]本发明还提供了一种二氧化锰薄片模拟酶传感器，该二氧化锰薄片模拟酶传感器通过上述的方法制备而成。
[0010]本发明也提供了一种Τ4ΡΝΚ的检测方法，包括:
[0011 ] I)将不同已知浓度的Τ4ΡΝΚ溶液与上述的二氧化锰薄片模拟酶传感器进行接触反应；
[0012]2)待反应体系的颜色稳定后，检测反应体系的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，Τ4ΡΝΚ的浓度为横坐标绘制标准曲线或者获得标准曲线方程；
[0013]3)将未知浓度的Τ4ΡΝΚ溶液与上述的二氧化锰薄片模拟酶传感器进行接触反应，接着检测反应体系的吸光度，然后根据标准曲线或者标准曲线方程以得知未知浓度的T4PNK溶液的浓度。
[0014]通过上述技术方案，本发明提供的二氧化锰薄片模拟酶传感器的反应机理如图1所示:在二氧化锰薄片模拟酶传感器中，二氧化锰纳米片能够起到模拟酶的功效，在模拟酶的存在下，TMB能够被催化显色为深蓝色，而未经过磷酰化反应的发夹DNA不能够被λΕΧΟ切割为单链，仍然以双链的形式存在；一旦二氧化锰薄片模拟酶传感器中加入Τ4ΡΝΚ，由于Τ4ΡΝΚ能够与发夹DNA的5 ’端磷酰化反应，进而使得DNA能够给特异性的λΕΧΟ切割为单链，此时的单链DNA对于二氧化锰模拟酶的活性有抑制作用，进而使得TMB的颜色逐渐变淡;整个体系的颜色的深浅与Τ4ΡΝΚ的浓度的对数呈线性关系，进而使得本发明提供的二氧化锰薄片模拟酶传感器对于Τ4ΡΝΚ的检测具有优异的灵敏度和检测限。此外，本发明提供的比色模拟酶传感器的制备过程中使用的是无标记的DNA，操作简单，成本很低，避免任何化学标记和修饰，从而使得该传感器便于大范围的使用。
[0015]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0016]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0017]图1是本发明提供的二氧化锰薄片模拟酶传感器的工作原理图；
[0018]图2是检测例I中MnO2纳米片的低倍SEM图；
[0019]图3是检测例I中MnO2纳米片的高倍SEM图；
[0020]图4是检测例2中紫外吸收光谱图；
[0021]图5是检测例3中紫外吸收光谱图；
[0022]图6是应用例I中紫外吸收光谱图；
[0023]图7是图6中最高吸光强度结果统计图；
[0024]图8是应用例2中不同浓度的λΕΧΟ的紫外吸收光谱图；
[0025]图9是应用例2中不同浓度的ATP的紫外吸收光谱图；
[0026]图10是应用例3中不同培养时间的紫外吸收光谱图。
【具体实施方式】
[0027]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0028]本发明提供了一种二氧化锰薄片模拟酶传感器的制备方法，包括:
[0029]I)将MnO2纳米片溶液与ΤΜΒ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0030]2)将发夹DNA溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)与λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0031]3)将MnO2-TMB混合溶液与DNA溶液混合以制得二氧化锰薄片模拟酶传感器。
[0032]在上述的制备方法的步骤I)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤I)中，MnO2纳米片溶液中MnO2的浓度为3-15mmol/L，TMB溶液的浓度为30-50mmol/L;并且相对于ImL的MnO2纳米片溶液，TMB溶液的用量为l_2mL。
[0033]在上述的制备方法的步骤I)中，混合条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤I)中，混合至少满足以下条件:混合温度为15-30°C，混合时间为4-1 Omin。
[0034]在上述的制备方法的步骤2)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤2)中，相对于10nmol的发夹DNA，ATP的用量为10-15ηπιο1，λΕΧ0的用量为10-15U，Tris-HCl缓冲溶液的用量为20-30yL;
[0035]在上述的制备方法的步骤I)中，Tris-HCl缓冲溶液以及DNA的种类可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，Tris-HCI缓冲溶液的pH为7.1-7.5，发夹DNA的序列号为5 ’ -GGCCTTGGATTGAAGGGAGCTCTACGGCC-3’。
[0036]在上述的制备方法的步骤3)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤3)中，相对于I体积份的DNA溶液，MnO2-TMB混合溶液的用量为3-5体积份。
[0037]在上述的制备方法的步骤3)中，混合条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤3)中，混合至少满足以下条件:混合温度为15-30°C，混合时间为15-25min。
[0038]在本发明中,MnO2纳米片溶液的制备方法可以是本领域中任何一种常规的制备方法，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，在步骤I)之前，该制备方法还包括:将TMA(四甲基胺盐)溶液、H2O2溶液与锰源进行接触反应以制得Μηθ2纳米片溶液。
[0039]在上述MnO2纳米片溶液的制备方法中，各物料的用量可以在宽的范围选择，但是为了使得制得的二氧化锰薄片模拟酶传感器具有更优异的灵敏度和检测限，优选地，TMA溶液的浓度为1-1.5mmol/L，H202溶液的浓度为20-40重量％ ;并且，相对于Ig的锰源，TMA的用量为15-25mL，H2O2溶液的用量为2_4mL。
[0040]在上述MnO2纳米片溶液的制备方法中，TMA以及锰源的具体种类可以在宽的范围选择，但是从成本上考虑，优选地，TMA为四甲基氢氧化铵，锰源为四水合氯化锰硫酸锰、氧化猛和氢氧化猛中的一种或多种。
[0041]在上述MnO2纳米片溶液的制备方法中，接触反应的条件可以在宽的范围选择，但是为了提高纳米二氧化锰的产率，优选地，接触反应至少满足以下条件:反应温度为15-25°C，反应时间为10-20s。
[0042]本发明还提供了一种二氧化锰薄片模拟酶传感器，该二氧化锰薄片模拟酶传感器通过上述的方法制备而成。
[0043 ]本发明也提供了一种T4PNK的检测方法，包括:
[0044]I)将不同已知浓度的T4PNK溶液与上述的二氧化锰薄片模拟酶传感器进行接触反应；
[0045]2)待反应体系的颜色稳定后，检测反应体系的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，T4PNK的浓度为横坐标绘制标准曲线或者获得标准曲线方程；
[0046]3)将未知浓度的T4PNK溶液与上述的二氧化锰薄片模拟酶传感器进行接触反应，接着检测反应体系的吸光度，然后根据标准曲线或者标准曲线方程以得知未知浓度的T4PNK溶液的浓度。
[0047]在上述检测方法中，为了便于T4PNK、发夹DNA以及λΕΧΟ之间能够充分地反应，优选地，在步骤I)中，接触反应首先在30-40°C下反应25-35min，然后在70-80°C下反应5-15min。
[0048]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，牌号A40的发夹DNA(序列号:5 ’-GGCCTTGGATTGAA GGGAGCTCTACGGCC-3 ’)、ATP和T4PNK( 10U/uL)为上海生工公司的市售品，AEX0(10U/uL)是赛默飞世尔公司的市售品，H202(30wt% ) ,MnCl2.4H20(99.99%)为国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)的市售品。
[0049]紫外吸收光谱是通过日本日立公司牌号为UV-3010的紫外-可见分光光度计的检测而得，SEM检测室通过日本日立公司牌号为S-4800的电子扫描显微镜的检测而得。
[0050]制备例I
[0051 ] MnO2纳米片溶液的制备:
[0052]利用“K.Kai ,Y.Yoshida ,H.Kageyama ,G.Saito ,T.1shigaki , Y.Furukawa andJ.Kawamata，J.Am.Chem.Soc.,2008,130,15938-15943.”报道的方法进行制备:在25°C的敞口条件下，将12mL的四甲基氢氧化铵溶液(1.0M，溶剂为水)、2mL的H2O2溶液(30wt %，溶剂为水)，加入至1mL氯化锰溶液中(含有0.593g的MnCl2.4H20)反应15s以制得MnO2纳米片溶液。
[0053]实施例1
[0054]I)在25°C下，将ImL的上述MnO2纳米片溶液(1mM)与ImL的TMB(40mM)溶液混合5m