一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农产品检测技术领域，尤其设及一种半定量免疫胶体金试纸条及其应 用。
【背景技术】
[0002] 氣哇诺酬类(FluomquinoIones，FQNs)抗生素是一类广谱的化学合成抗菌药物，是 哇诺酬类抗生素在其主环6或8位加入氣原子后的衍生物。由于氣哇诺酬类药物价格低廉且 治疗效果好，因此近年来被广泛应用到水产养殖中预防、治疗鱼类疾病。但是在长期使用过 程中，人们逐渐发现该类药物的过量或不当使用会造成动物产品中残留和蓄积。人食用有 FQ化残留的食品后，人体正常的肠道菌群被破坏而引起肠道功道素乱，此类药物影响儿童 骨骼发育，易引起肝损害和关节病变，还可诱发癒痛和神经症状;人类长期食用含较低浓度 FQ化药物的食品，容易诱导细菌耐药性的传递，甚至产生超级细菌，从而影响该类药物的临 床疗效。
[0003] 目前，HPLC法和LC-MS/MS法是国际上最常用来测定氣哇诺酬类药物残留的方法， LC-MS/MS法可W利用待测分子的结构来定性，可W排除ELISA和HPLC法检测的假阳性结果， 用W确证检测结果。但运两种检测方法设及到大量的有机溶剂处理，过程比较复杂，周期也 比较长，操作时需要专口的技术人员，难W满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。
[0004] ELISA测定的基础是抗原抗体反应，该法精确、灵敏，检测时间大大缩短，但是 ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。此外化ISA试剂 寿命短，因此需要低溫保藏。
[0005] 基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试 样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫 学检测方法更实际。
[0006] 胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检 测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反 应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果W肉 眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。
[0007] 不同的国家和地区对FQNs残留限量要求不同，如美国FDA于2005年宣布禁止用于 治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用，对海产品中FQNs残留零容忍，对方 法检出限要求为扣g · kg-i。我国农业部235号公告中规定了环丙沙星、达氣沙星、恩诺沙星、 沙拉沙星、二氣沙星、嗯哇酸和氣甲哇等7种哇诺酬药物(QNs)在动物肌肉中的最高残留限 量(M化)为10~50化g · kg-i;而在奶、肝、肾和蛋中的ML分别为30~100、80~1900、80~ 3000和50yg . kg-i;不同人群对食用农产品质量安全的需求也有差异，尤其是孕妇、儿童和 特殊体质人群，即使摄入较低浓度Q化药物的食品，也可能产生一些不良反应。
【发明内容】
[0008] 本发明针对不同国家和地区对药物残留限量要求不同，提供了一种半定量免疫胶 体金试纸条及其应用，该试纸条具有两条控制线，符合两种不同限量要求，重现性好，检测 时间短，适合现场快速检测。
[0009] 本发明提供了一种免疫胶体金试纸条，包括控制线，所述控制线至少为两条，不同 控制线上包被有不同浓度的二抗。
[0010] 该免疫胶体金试纸条包括:样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫;相邻各部分间有 l-2mm的重叠 W保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
[0011] 所述免疫胶体金试纸条还包括标记物垫和检测线，所述检测线上包被有抗原，所 述标记物垫上包被有能够与所述抗原反应的胶体金标记的抗体。
[0012] 进一步，当药残限量值与抗体的最低检测限接近的情况下，解决Cl显色太浅的运 一问题的办法是加入其它与检测线上抗原不反应的抗体，提高质控线显色效果的稳定性， 提高半定量试纸条的检测灵敏度，同时可降低生产线调试的难度。
[0013] 作为优选，所述标记物垫上还包被有与所述抗原不反应的胶体金标记的抗体。进 一步地，所述抗原不反应的胶体金标记的抗体为横胺二甲喀晚多克隆兔抗或巧喃妥因代谢 物鼠抗。
[0014] 作为优选，所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗氣哇诺酬类药物单克隆抗 体;所述抗原为氣哇诺酬类药物与载体蛋白偶联的偶联物。
[0015] 具体地，所述免疫胶体金试纸条反应膜的检测线(T线)处包被有环丙沙星-卵清蛋 白偶联物(CIP-0VA)或环丙沙星-牛血清蛋白偶联物(CIP-BSA)，所述反应膜的质控线(C1和 C2线)处包被有二抗。
[0016] 所述抗氣哇诺酬类药物单克隆抗体由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生;所 述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株5H化犯8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型 培养物保藏中屯、（Qiina Center for Type Qilture Collection,简称CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO. C2015118;中国典型培养物保藏中屯、的地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0017] 所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
[0018] (1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得 能够产生抗哇诺酬类药物抗体的脾细胞；
[0019] (2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
[0020] 其中，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10~30;所述偶联物的偶联比 为2~6:1。
[0021] 作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
[0022] 具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。
[0023] 所述单克隆抗体的亚型为IgGiA链，与哇诺酬类药物有特异性反应。所述单克隆抗 体通过体外培养的方式获得。
[0024] 所述的氣哇诺酬类药物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氣沙星、诺氣沙星、丹诺沙星、沙 拉沙星、麻保沙星、培氣沙星、洛美沙星、双氣沙星、依诺沙星、氣甲哇、加替沙星、嗯哇酸、氣 罗沙星和司帕沙星中的至少一种。
[00巧]作为优选，所述胶体金的粒径范围为20~80nm。
[00%]具体地，所述控制线上包被有羊抗鼠 IgG或羊抗兔IgG。
[0027]本发明提供了一种免疫胶体金试剂板，包含所述的免疫胶体金试纸条。
[002引本发明试剂条和试剂板采用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应 显色，特异性检测样品中的氣哇诺酬类药物残留水平。
[0029] 本发明还提供了所述免疫胶体金试纸条在检测食用农产品中药物残留的应用。所 述食用农产品为畜禽肉或水产品。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0031] (1)本发明免疫胶体金试纸条能够对食用农产品中氣哇诺酬类药物残留量实现半 定量快速检测或现场检测。
[0032] (2)本发明免疫胶体金试纸条灵敏度高，特异性好，对农产品中16种氣哇诺酬类药 物的最低检出限可达1~lOyg · kg-i，适用于各类企业及检测机构;对青霉素、氯霉素、链霉 素、四环素或横胺喀晚等抗菌素的交叉反应率均低于1%，可见，本发明免疫胶体金试纸条 对氣哇诺酬类药物反应具有高度专一性。
[0033] (3)本发明免疫胶体金试纸条的操作简单快捷，将反应所需的大部分原料整合到 PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特 殊处理，滴样后1-5分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深 浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。
[0034] (4)本发明免疫胶体金试纸条成本低，易推广，生产工艺简单，流程成熟，投资少， 收效快。
[0035] (5)本发明为解决Cl显色太浅的问题又在标记物垫上包被了与检测线上抗原不反 应的抗体，提高了质控线显色效果的稳定性，提高了半定量试纸条的检测灵敏度，同时也降 低了生产线调试的难度。
【附图说明】
[0036] 图1为氣哇诺酬类药物免疫胶体金快速检测试剂板背衬的结构示意图，其中1为样 品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线(Τ)，5为高含量控制线(C2)，6为低含 量控制线(Cl )，7为吸水垫，8为不干胶，9为PVC底板。
[0037] 图2为氣哇诺酬类药物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔， Cl、C2为控制区，T为检测区。
[0038] 图3为氣哇诺酬类药物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图；
[0039] 其中，打为低含量控线、C2为高含量控制线，T为检测线。
[0040] 图3.a,T比Cl显色深，表示样品中FQ化残留量X<Ci;图3.b T与Cl显色一样深，表示 样品中FQ化残留量X = Ci;图3.C T比Cl显色浅，但比C2显色深，表示样品中FQ化残留量Ci<X <C2;图3.d T与C2显色一样深，表示样品中FQ化残留量X = C2;图3.e T比C2显色浅，表示样 品中FQ化残留量X>C2;图3.f T不显色，表示样品中FQ化残留远高于C2;图3.g表示试剂板已 部分失效;图3. h表示试剂板已完全失效。
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