· kg^，T比C2显色浅，表示样品中FQNs残留量 >20yg · kg-i。
[0125] 3.检测结果
[0126] 检测30个鸡蛋样品，检出FQ化残留量<2yg · kg^l7个（阴性鸡蛋），FQ化残留量为2 ~20yg · kg-ig个，FQNs残留量>20yg · kg-14个。
[0127] 4.留样加标试验
[012引取上述3个阴性鸡蛋的蛋液，分别添加1.0、2.0、5.0、20、1004邑-1^-1环丙沙星标准 溶液。添加 l.Oyg · kg-iCIP，T比Cl显色深；添加2.0yg · kg-iCIP标液，2个T与Cl显色一样深 (如图3.b所示），1个T比Cl显色浅（经液相色谱-串联质谱法验证，该阴性样品中含有1.化 g · kg-中QNs);添加5.0yg · kg-iCIP标液，T比Cl显色浅，但比C2显色深;添加20yg · kg-iCIP标 液，T与C2显色一样深;添加 l(K)yg · kg-iCIP标液，T比C2显色浅。
[0129] 取上述1个阴性鸡蛋的蛋液，分别添加扣g/kg恩诺沙星、氧氣沙星、洛美沙星、诺氣 沙星、达氣沙星、氣甲哇、嗯哇酸、氣罗沙星、双氣沙星、沙拉沙星和司帕沙星的检出限为，及 1化g/kg麻保沙星、培氣沙星、依诺沙星和加替沙星化kCi显色浅，但比C2显色深。
[0130] 5.交叉反应试验
[0131] 取上述的2个阴性鸡蛋的蛋液，2化L lOOmg/L氯霉素、链霉素、四环素或横胺喀晚 标准品做不同类型抗菌素的交叉反应试验，试验表明试剂条上的T线显色均比Cl线略深，判 断为阴性，因此该GICT试剂条与氯霉素、链霉素、四环素或横胺喀晚的交叉反应率<1%。
[0132] 实施例3添加同源抗体制备FQ化高灵敏度半定量免疫胶体金试纸条
[0133] (1)胶体金标记抗体:取胶体金lOOmL，用0.1mol/L Tris-肥1溶液调胶体金溶液抑 到8.6，置于磁力揽拌器上，边揽拌边加入0.2mg · mL-中QNs单抗ImL，开始计时，2min后，加入 0.5mg · mL-i的巧喃妥因代谢物(AHD)鼠抗0.4mL，4min后加入0.5mg · mL-i的BSA ImL，揽拌 15min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，揽拌15miru4°C放置于过夜， 15，000rpm离屯、60min，弃上清液。将沉淀用lOmL胶体金复溶液溶解，再15 ,ΟΟΟ?φπι离屯、 60min，弃上清液，W去除未标记上的抗体，重复纯化金标抗体一次。将沉淀用5mL胶体金复 溶液溶解，W〇. 22皿无菌滤膜过滤后，4°C保存备用。
[0134] (2)开启BI0D0T 3210Ξ维喷点平台的气动喷头(Airjet)，将上述胶体金标记的抗 体均匀喷洒在胶体金结合垫，37Γ烘箱干燥过夜。
[0135] (3)开启BI0D0T 3210Ξ维喷点平台的BioJet喷头，用3mg ?mL-iCIP-BSA喷NC膜的T 线，W〇.03mg · mL-i羊抗鼠 IgG喷C2线，再W〇.3mg · mL-i羊抗鼠 IgG喷Cl线，37°C烘箱干燥化。
[0136] (4)检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维 素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂 板，再放入带干燥剂的侣锥袋中密闭储存。
[0137] (5)添标测试:取阴性鸡肉样品提取液，分别添加 CIP标液至终浓度为0、2、20ng· ml/i，每个添标浓度滴3片试剂板。添标Ong · ml/i，T线显色比Cl深;添标2ng · ml/i，T与Cl显色 一样深;添标20ng · ml/i，T与C2显色一样深。在阴性鸡肉样品提取液添加 A皿标液至终浓度 为500、1000ng · m[i，滴板测试时T线显色比均Cl深。说明试剂板的Cl和C2质控线对应FQ化浓 度分别为2ng · ml/1和20ng · ml/1，与A皿无交叉反应。
[013引杂交瘤细胞株5mE犯8D7H12所产抗体化ISA方法检测对CIP的50%抑制浓度（IC50) 为0.396ng · ml/i，制备只有1条质控线的普通免疫胶体金试纸条，其对CIP最低检出限可达2 yg · kg^，但如果不加其它抗体制备有2条质控线半定量免疫胶体金试纸条，其对CIP最低检 出限只能达到扣g · kg-i，标记时加入其它同源抗体后，半定量免疫胶体金试纸条最低检出 限才能达到24肖·
[0139] 因为试纸条的反应原理为竞争法抗原-抗体反应，样品中的FQNs与抗体结合后抑 制了抗体与T线上抗原的结合，所W当金标FQNs抗体量较少时，试剂条的检测灵敏度较高， 例如· ml/iFQ化抗体量进行单独标记，制备半定量试纸条，因金标抗体量太少，会出现 Cl线显色太浅（如图8.a)或不显色（如图8.b)的情况；只有提高标记时所用FQNs抗体量，才 能确保有足够的金标抗体在Cl线显色（如图8. C)，因此，如果不加其它抗体制备有2条质控 线半定量免疫胶体金试纸条，最低检出限只能达到扣g · kg^，而当标记时加入其它同源抗 体后，半定量免疫胶体金试纸条最低检出限才能达到24肖·
[0140] 实施例4添加不同源抗体制备FQ化高灵敏度半定量免疫胶体金试纸条
[0141 ] (1)取胶体金lOOmL加入0.2mg ·血-ipQNs单抗ImL进行标记，将金标FQNs抗体喷洒 在胶体金结合垫1，烘干备用。
[0142] (2)取胶体金lOOmL加入0.3mg · mL-i横胺二甲喀晚(SMZ)多克隆兔抗ImL进行标记， 将金标FQ化抗体喷洒在胶体金结合垫2,烘干备用。
[0143] (3)开启BI0D0T 3210Ξ维喷点平台的BioJet喷头，用2mg ?mL-iCIP-OVA喷NC膜的T 线，W〇.03mg · mL-i羊抗鼠 IgG喷C2线，再W〇.35mg · mL-i羊抗兔IgG喷Cl线，37°C烘箱干燥 她。
[0144] (4)检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫2、、胶体金 结合垫1、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板 中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的侣锥袋中密闭储存。
[0145] (5)添标测试:取阴性鸡肉样品提取液，分别添加 CIP标液至终浓度为0、2、20ng· ml/i，每个添标浓度滴3片试剂板。添标Ong · ml/i，T线显色比Cl深;添标2ng · ml/i，T与Cl显色 一样深;添标20ng · ml/i，T与C2显色一样深。在阴性鸡肉样品提取液添加 SMZ标液至终浓度 为500、1000ng · m[i，滴板测试时T线显色比均Cl深。说明试剂板的Cl和C2质控线对应FQ化浓 度分别为2ng · mL-i和20ng · mL-i，与SMZ无交叉反应。
[0146] 生产线的调试过程简单、易操作，标记方法和C2线调整程序与生产普通的定性免 疫胶体金试纸条相同，Cl线调整时直接根据在添标量为Cl浓度时T线显色深度调整即可。
【主权项】
1. 一种免疫胶体金试纸条，包括控制线，其特征在于，所述控制线至少为两条，不同控 制线上包被有不同浓度的二抗。2. 如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，还包括标记物垫和检测线，所 述检测线上包被有抗原，所述标记物垫上包被有能够与所述抗原反应的胶体金标记的抗 体。3. 如权利要求2所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述标记物垫上还包被有与所 述抗原不反应的胶体金标记的抗体。4. 如权利要求2所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗体为胶体 金标记的抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体;所述抗原为氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联的偶 联物。5. 如权利要求4所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述抗氟喹诺酮类药物单克隆 抗体由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生;所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株 5H1E9E8D7H12,保藏编号为CCTCC N0.C2015118。6. 如权利要求2所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金的粒径范围为20~ 80nm〇7. 如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述控制线上包被有羊抗鼠 IgG或羊抗兔IgG。8. -种免疫胶体金试剂板，其特征在于，包含如权利要求1~7任一所述的免疫胶体金 试纸条。9. 如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条在检测食用农产品中药物残留的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用，该试纸条包括控制线，所述控制线至少为两条，不同控制线上包被有不同浓度的二抗。本发明免疫胶体金试纸条能够对食用农产品中氟喹诺酮类药物残留量实现半定量快速检测或现场检测；灵敏度高，特异性好；对农产品中16种氟喹诺酮类药物的最低检出限可达1～10μg·kg-1，适用于各类企业及检测机构；对青霉素、氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶等抗菌素的交叉反应率均低于1％。CCTCC NO.C201511820150826
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105628923
【申请号】CN201610094288
【发明人】柳爱春
【申请人】杭州市农业科学研究院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月19日