一种用于肾小管细胞损伤检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于肾小管细胞损伤检测的试剂盒。肾小管细胞损伤包括但不限于缺血性和肾毒性肾损伤，所述顺斋的检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明提供的试剂盒能够特异性的检测样本中的NGAL蛋白的含量，从而能够快速高效的检测肾小管细胞损伤。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用。
【专利说明】
一种用于肾小管细胞损伤检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于肾小管细胞损伤检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 继发于肾小管细胞损伤（包括缺血性损伤或肾毒性损伤）的急性肾功能衰竭 (Acute renal failure)(ARF)，尽管在支持疗法中取得重大的进展，仍是临床医学和肾病 学(nephrology)中的普遍而具有潜在破坏性的难题，其具有持续的高死亡率和高发病率。 几十年来的前期研究已经说明持续的血管收缩、肾小管阻塞、细胞结构和代谢改变和炎症 反应在ARF发病机理中的作用。虽然这些研究已经在动物模型中显出可能的治疗手段，但是 到人体中平移研究的努力却产生令人失望的结果。其原因可包括肾对于缺血性损伤和肾毒 素的多方面的反应，和ARF早期生物标记物的缺乏，造成迟误开始治疗。
[0003] 当患者的血清肌酸酐（creatinine)值或者：（1)当基线血清肌酸酐水平小于 2.Omg/dL时，增加至少0.5mg/dL; (2)当基线血清肌酸酐水平大于或等于2.Omg/dL时，增加 至少1 .5mg/dL;或（3)不管基线血清肌酸酐水平为何，作为暴露于放射成像剂 (radiographic agent)的结果增加至少0.5mg/dL时，即认为个体患有急性肾功能衰竭。 [0004]人们相信，在所述的疾病过程中治疗的早期介入会降低与ARF有关的死亡率并缩 短各种类型的肾小管细胞损伤的治疗时间，所述的肾小管细胞损伤包括但不限于缺血性和 肾毒性肾损伤。肾小管细胞损伤的可靠的早期生物标记物的鉴定对于促进早期治疗干预是 有用的，并通过提供肾毒性的指标有助于指导药物开发。
[0005] 检测肾病的传统的实验室方法包括测定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率、 尿电解质、尿沉淀物的显微镜检查及放射学研究。这些指标既没有敏感性和特异性，又不能 用于该疾病的早期检测。实际上，虽然血清肌酸酐的升高被普遍地认为是检测ARF的"黄金 标准(gold standard)"，但是很显然，在血清肌酸酐变化的时间内，肾功能已经丧失50%之 多。
[0006] 较早已经描述了少数缺血性肾损伤的尿生物标记物，包括肾损伤分子-l(KIM-l) 和半胱氨酸富含蛋白61(07说1)。碰-1是一个涉及肾再生的假定的粘附分子。在缺血-再灌 注损伤的大鼠模型中，发现KM-1在初始损伤后的24-48小时上调，使其成为可靠但有些晚期 的标记物。近期研究已经显示，MM-1可在肾活组织检查中和患有缺血性急性肾小管坏死的 患者的尿中检测到。然而，这种检测在已形成确定的缺血性肾损伤的患者中、在该疾病的晚 期也已证明。测定尿KM-1用于检测早期ARF或临床症状不明显的肾损伤的效用还远远没有 得到验证。
[0007] 肾小管细胞损伤的生物标记物可以是即时的RTCI生物标记物，如NGAL，其可出现 在发生肾小管细胞损伤2小时之内的尿中。即时的RTCI生物标记物能够，如在NGAL的情况 下，立即出现在发生肾小管细胞损伤的实验体的第一次尿出物中。RTCI生物标记物也可以 是早-发RTCI生物标记物，其可出现于发生肾小管细胞损伤的最初24小时之内。同样地， NGAL也是早-发RTCI生物标记物的实例。
[0008] 现有技术中检测NGAL蛋白的量一般通过抗体结合之后通过酶联免疫反应进行定 量检测，但是该检测方法需要自备相应的抗体，由于抗体的制备要求比较高，并且制备复 杂，在检测中存在着巨大的局限。
[0009] SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可 以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是 体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合 的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮 的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的 核酸分子被洗去，而与革G物质有强未和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯 度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体 后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技术，筛选特定的结合NGAL的适配体具有较为重要的意义。
【发明内容】
[0010]本发明的技术方案通过以下步骤实现：
[0011]本发明的目的是提供一种NGAL的核酸适配体序列。
[0012]本发明中，所述的NGAL的核酸适配体(序列卜21)能够特异结合NGAL。
[0013] 本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序 列应用，可进一步用于制备特异性结合NGAL的试剂盒。
[0014] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5'
[0015] -AACTGGCCATGAACCTTTGA-N36-CCGAGACTTTAGACTCTAAG-3，），其中N36为36个随机 寡核苷酸；从中筛选出与N G A L特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1 : AACTGGCCATGAACCTTTGA;引物P2: CTTAGAGTCTAAAGTCTCGG，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司），转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司）；挑去白色菌落进 行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。
[0016] 本发明采用核酸适配体的体外筛选（SELEX)技术，以NGAL为正筛靶标筛选与NGAL 特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合NGAL的序列，本发明中命名为适配体NGAL-1~ 21。序列如下：
[0059] 本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检 测NGAL。
[0060] 本发明的有益效果:获得了一种能够特异检测NGAL的试剂盒，该试剂盒成本低廉， 可以大面积推广使用。
【具体实施方式】
[0061] 实施例1:蛋白的获得
[0062]按照现有技术的真核表达方法，获得相应的蛋白。比如采用CN1978632A中的方法， 获得NGAL蛋白浓度为100mg/mL的蛋白储存液。
[0063]实施例2核酸适配体筛选
[0064]从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5'
[0065] -AACTGGCCATGAACCTTTGA-N36-CCGAGACTTTAGACTCTAAG-3，），其中N36为36个随机 寡核苷酸；
[0066] 引物PI :AACTGGCCATGAACCTTTGA;引物P2:CTTAGAGTCTAAAGTCTCGG。
[0067] (l)NGAL蛋白lmg溶于200μ1 PBS后加入96孔ELISA板中，4°C过夜。
[0068] (2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200μ1 3%BSA(购自上海生工），孵育2小时。 同时，空白96孔ELISA板中加入200μ1 3%BSA 37°C孵育2小时。
[0069] (3)将随机 ssDNA 文库（首轮用量为 800pmol)溶于 200μ1 1*SHCMK，95°C 变性 5min。 立即置于冰上lOmin，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
[0070] (4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小时。
[0071] (5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37°C孵育2小时后PBS洗涤6次。
[0072] (6)结合了 ssDNA的酶标孔用200 i 11洗脱缓冲液重悬，95 °C加热5min，取上清，经过 乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作为下一轮筛选的模板。
[0073] (7)取5μ1 PCR产物上样于5wt%琼脂糖(购自上海生工），观察条带位置是否正确。 从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行13个循环。
[0074] 第13轮筛选产物的扩增和纯化:将第13轮筛选得到的ssDNA序列，用引物PI，引物 P2进行扩增。100μΙ PCR扩增后体系加入500pl结合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/L CaCl2，lmmol/L MgCl2，l%BSA)，充分混匀。将上一 步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室温放置lmin，12000rpm离心60s，倒 掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液ΒΒ+0 · 05%Tween20)，12000rpm离心30s，弃 掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中， 12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 20pmol 65°C水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12，OOOrpm离心lmin。将得到的溶液 重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
[0075] PCR纯化产物的克隆：取ΙμL扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接， 再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平 板，倒置培养皿，于37°C培养12-16小时进行"蓝-白斑筛选"。测序：用接种环挑取筛选平板 上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37°C培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后 送上海生工测序。
[0076] 测序结果发现其中有21个核酸适配体序列与NGAL具有非常强的亲和性，该21个序 列分别是：SEQ ID NO :1-21所示。
[0077] 实施例2特异性高亲和力的NGAL结合适配子的性能测定
[0078] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32Ρ]ΑΤΡ于去磷酸化的适配体分子末端。lOnmol放 射性标记的适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的NGAL蛋白37°C孵育30min，各组反应液经硝 酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平 行做两次测定。计算各个适配子与NGAL蛋白的解离常数。结果如下：
[0081 ]实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
[0082]从以上结果可以看出，本发明的21个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合NGAL蛋白。
[0083]实施例4降解活性分析
[0084]分别米用人血白蛋白，Lcn2蛋白、Lcnl蛋白、脂质运载蛋白8(LCN8)与21条适配子 进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与NGAL蛋白 结合保持较高的特异性。
[0085] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0086]实施例5临床试验分析
[0087]取30组临床尿液样本，患有肾脏损伤或急性肾衰竭患者25例作为实验样本，5例为 正常人。
[0088] 将21个适配子分别与标准品NGAL蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检测 的标准曲线。然后将30组临床血清样本分别去10μ1加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡 溶解。分别将偶联有磁珠的21组适配子与30组的血清溶液混合孵育20分钟（一种适配子对 应检测30组血清样本），而后磁分离，即可获得相应的分离的NGAL蛋白，通过标准曲线浓度 检测发现，25组肾脏损伤或者急性肾衰竭患者的NGAL蛋白浓度分别为正常人的大约增长10 倍以上，具有极大的差异显著性，说明可以用于检测分析。
[0089]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肾小管细胞损伤检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括能特异性检测 肾小管细胞损伤的适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述适体为SEQ ID No. 1-21任一条序列所 示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒在检测肾小管细胞损伤的应用。4. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒用于制备检测肾小管细胞损伤的试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106018826SQ201610364487
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月29日
【发明人】孟繁好
【申请人】孟繁好