一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于生物工程领域，尤其涉及一种空肠弯曲菌，具体来说是一种空肠 弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹泻病 人粪便中分离出来，目前已认识其为人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病 率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家发病率几乎等同于细菌性痢疾。本菌作为重 要的食源性致病菌，随着食物进入肠道后在含微量氧环境下迅速繁殖，主要侵犯空肠、回肠 和结肠，侵袭肠粘膜，造成充血及出血性损伤，近年来观察到有些菌株能产生类似霍乱肠毒 素，引起肠腔内液体分泌增加。
[0003] 目前空肠弯曲菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、 检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定 的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品。 【实用新型内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本实用新型提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金 快速检测试纸条，所述的这种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条解决了现有技术中检 测空肠弯曲菌操作复杂，周期长的技术问题。
[0005] 本实用新型提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：包括样 品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金 标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在 所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远 离所述的金标垫的一侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，由抗空肠弯曲菌单克隆抗体和胶 体金结合后形成金标抗体，所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由抗空肠弯曲菌 单克隆抗体作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。
[0006] 在一优选例中，所述的质控线由羊抗兔抗体或者羊抗鼠抗体组成。
[0007] 在另一优选例中，所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫设置在一个底板 上。
【附图说明】
[0008] 图1是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗 SDS-PAGE电泳图；
[0009] 图2是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联 胶体金pH结果；
[0010] 图3是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联 胶体金结合量结果；
[0011] 图4是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；
[0012] 图5是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的不同抗体组 合结果；
[0013] 图6是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸 条灵敏度结果；
[0014] 图7是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸 条交叉反应结果；
[0015] 图8是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的模拟带菌结 果。
【具体实施方式】
[0016] 本实用新型的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处 理液加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经 金标垫时，使金标垫上的与胶体金耦联的单克隆抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水 垫移动，与胶体金耦联的单克隆抗体可与样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合 物流至检测线时，即被检测线的单克隆抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体， 在硝酸纤维素膜上的检测线位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质 控线的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。阳性标本既 显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
[0017] 本实用新型的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCCN0. 8457的杂交瘤细 胞株分泌产生，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCCN0. 8766的杂交瘤细胞株分 泌产生。
[0018] 本实用新型包括具有与抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3、3G2D8H3G9的相应 氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产 物。具体地，本实用新型包括具有含超变区（互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白 质或蛋白质偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本 实用新型的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领 域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子（cytokine)、放 射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的 偶联物。本实用新型还包括与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或 抗原。
[0019] 对于本实用新型的抗空肠弯曲菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测 定。抗空肠弯曲菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementaritydetermining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本实用新型包括 那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗空肠弯曲菌单克 隆抗体CDR具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本实用新型不仅包括完整的单 克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0020] 本实用新型还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列 可以用常规技术，利用杂交瘤细胞系（CGMCCNo. 8457)或（CGMCCNo. 8766)获得。此外，还 可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0021] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0022] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0023]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本实用新型蛋白（或其片段，或其 衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或 如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本实用新型蛋白序列中。
[0024] 本实用新型还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载 体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0025] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0026] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaClJi 处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电 穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规 机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0027] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本实用新型的基因所编码的多肽。根据 所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条 件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学 诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0028] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析（凝胶过 滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法 的结合。
[0029] 本实用新型的抗抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3、3G2D8H3G9,其效价高（可 以达到1:100000)，能够特异性地、高效地检测空肠弯曲菌，与出血性大肠杆菌0157:H7、阴 沟肠杆菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌、伊氏李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲 型副伤寒沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、宋内氏志贺、福氏志贺氏菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌等共计91种病原细菌均无交叉反应，此 为本实用新型的最大创新点。上述单克隆抗体3G2D8H3G9可以用辣根过氧化物酶、碱性磷 酸酯酶、纳米金颗粒标记，专一性地作为检测抗体使用。
[0030] 本实用新型和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本实用新型由于采用了新 筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对空肠弯曲菌的检测特异性和 灵敏性均较高。
[0031] 以下结合附图介绍本实用新型的具体实施例：
[0032] 首先介绍本实用新型实施例中所使用的试剂与仪器：
[0033] 主要试剂
[0034] 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma;BSA购于上海世泽生物 科技有限公司；胶体金溶液购于上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）135S Millipore;羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔购于上