羊抗鼠抗体作为金标单抗试纸 条的Controlline，即控制线，也称C线。也可以用以羊抗兔抗体作为金标多抗试纸条的 Controlline。按表6中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养好的 菌液用生理盐水稀释至10s、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优 的抗体组合。表5中金标垫一列中的H3-Au-pad代表将单克隆抗体H3作为金标抗体与胶 体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，G9作为检测线；G9-Au-pad代表将单克隆抗 体G9作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，H3作为检测线。
[0089] 表6抗体不同配对组装试纸条
[0090]
[0091] 图5是本实用新型空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果。 如图5所示，其中，A为H3-G9组合结果；B为G9-H3组合结果。
[0092] 图5中各组试纸条中从左至右分别为采用10s、107、106、CFU/mL以及无菌生理盐水 进行测试的结果，由图5可知，A组合灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；B组合 灵敏度可达107CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较A组浅，综上，选用抗体组合效果 较好的A组，即H3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，G9喷涂于NC膜作T线来制作 本实用新型的空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条。
[0093] 5.试纸条灵敏度测定
[0094] 将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至10s、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均 以35μL分别滴加至使用A组单抗组合制作的试纸条的样品垫上进行检测，使用无菌生理 盐水为阴性对照，并重复三次。
[0095] 由图6可知，滴加浓度为10s、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/ mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL，三次重复结果均为106CFU/mL， 灵敏度稳定性较好。
[0096] 6.试纸条交叉反应实验
[0097] 利用以下食源性致病菌对制备的试纸条进行交叉反应实验：金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus(ATCC29213、ATCC27660)、大肠杆菌 0157:H7Escherichia coli0157:H7(ATCC43895、ATCC43889)、单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes(ATCC43251、ATCC13932、ATCC19112、ATCC19114、ATCC19116、 ATCC19117、ATCC19115)、猪霍乱沙门氏菌Salmonellacholeraesuis(CICC21493)、 鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphiumukriunm(CICC22956、ATCC14028)、肠炎沙门氏 菌Salmonellaenteritidis(ATCC13076)、福氏志贺氏菌Shigellaflexneri(ATCC 12022)、宋内氏志贺氏菌Shigellasonnei(ATCC25931)、病疾志贺氏菌Shigella dysenteriae(野生分离株）、鲍氏志贺氏菌Shigellaboydii(ATCC9207)、小肠结肠炎耶 尔森氏菌Yersiniaenterocolitica(ATCC23715、CMCC52207)、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus(ATCC17802)、坂崎肠杆菌（Enterobactersakazakii(ATCC29004、 ATCC29554)、空肠弯曲菌（Campylobacterjejunienteritis)(CICC22937、ATCC29428、 ATCC33291、ATCC33560、CICC6071)、乙型溶血性链球菌（Str印tococcusHemolytics^) (ATCC10373)、幽门螺旋杆菌（HelicobacterPylor)(ATCC43504)。
[0098] 用制备好的试纸条检测31株培养至10sCFU/mL的细菌并观察结果。
[0099] 图7是本实用新型实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸 条交叉反应结果。
[0100] 由图 7 可知，35yL浓度为 10sCFU/mL的空肠弯曲菌（CICC22937、ATCC29428、 ATCC33291、ATCC33560、CICC6071)菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他26株细菌相 同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测空肠弯曲菌，而和 其它食源性致病菌无交叉反应，且试纸条性能稳定，是一种较好的空肠弯曲菌快速检测产 品。
[0101] 实施例3免疫胶体金试纸条模拟带菌实验
[0102] 为了进一步验证本实用新型的胶体金试纸条的实际检测性能，培养空肠弯曲菌浓 度至10sCFU/mL，用生理盐水梯度稀释至103CFU/mL后各取100μL分别加入到25g(mL)的 市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB4789.9-2014《食品微生物学检验空肠弯曲菌》分别 向各样品中加入225mL布氏肉汤，36°C微需氧培养22h，期间每隔lh各取10mL样品待检，分 别取各样品各时间段培养物40μL滴加至样品垫进行检测。实验结果在图7中依次左至右 排列，用PBS作为阴性对照（每组排列在最后一个）。
[0103] 由图8可知，Α组面包样品增菌2-5h时，试纸条Τ线无显色，增菌6-12h时，Τ线显 色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU空肠弯曲菌的面包样品在增菌液中增菌6h即可被 检出；B组牛奶样品增菌2-6h时，T线无显色，增菌7-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说 明含有约200CFU空肠弯曲菌的牛奶样品在增菌液中增菌7h可被检出；C组果冻样品增菌 2-7h时，T线无显色，增菌8-12h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU空肠弯曲 菌的果冻样品在增菌液中增菌8h可被检出，三组模拟带菌检测中作为阴性对照的PBS均未 显色。以上结果说明本实用新型的空肠弯曲菌对实际样品具有很好的检测能力。
[0104] 综上所述，本实用新型筛选出了二株单克隆抗体，并通过实验验证，从中选取了综 合效果最好的两株单克隆抗体，其中H3作为金标抗体，G9作为检测抗体，制成免疫胶体金 试纸条。实验表明此种试纸条具有无交叉反应和灵敏度高的特点，并且在实际空肠弯曲菌 检测中表现出良好的检测性能和运用价值。
[0105] 生物材料的保藏
[0106] 本实用新型的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗空肠弯曲菌杂交瘤细胞，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研究所），保藏 日期为2013年11月15日，保藏号为CGMCCNO. 8457。
[0107] 本实用新型的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗空肠弯曲菌杂交瘤细胞，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研究所），保藏 日期为2014年1月9日，保藏号为CGMCCN0. 8766。
[0108] 在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技 术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种空肠弯曲菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：包括样品垫、金标垫、硝酸纤 维素膜和吸水垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤 维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在所述的硝酸纤维素膜 上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远离所述的金标垫的一 侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，由抗空肠弯曲菌单克隆抗体和胶体金结合后形成金标 抗体，所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由抗空肠弯曲菌单克隆抗体作为检测 抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。2. 如权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：所述的 质控线由羊抗兔抗体或者羊抗鼠抗体组成。3. 如权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：所述的 样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫设置在一个底板上。
【专利摘要】本实用新型公开了一种空肠弯曲菌免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远离所述的金标垫的一侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，由抗空肠弯曲菌单克隆抗体和胶体金结合后形成金标抗体，所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由抗空肠弯曲菌单克隆抗体作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。本实用新型由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对空肠弯曲菌的检测特异性和灵敏性均较高。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569, G01N33/558
【公开号】CN205038219
【申请号】CN201520713876
【发明人】方水琴, 万绍业, 杨标, 郭慧琴, 胡永辉, 刘箐
【申请人】上海慧耘生物科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年9月15日