海生工生物工程股份有限公司；单克隆抗 体亚型鉴定试剂盒购于ZYMEDCat:90-6550 ;Lot. 60907259。
[0035] 空肠弯曲菌等标准菌株购买自美国菌物保藏中心（ATCC)、中国医学微生物保藏中 心（CMCC)、中国工业微生物保藏中心（CICC)、质检总局检验检疫微生物保藏中心（IQCC)。
[0036] 主要仪器
[0037] 酶标仪SpectraMaxM2 购自MolecularDevices;Nanodrop2000C购自Thermo Scientific;点样仪AD6010购自BIO-DOT;扫描仪PhantomV9购自MICROTEK;恒温培养摇 床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogic?LP358BR5057购自BIO-RAD;单人净化 工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0038] 实施例1空肠弯曲菌单克隆抗体制备
[0039] 1.免疫原和阳性标准品的准备
[0040] 空肠弯曲菌（CICCNo. 22937)接种在布氏肉汤上，37°C、150r/min厌氧条件振荡 培养17h，计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整空肠弯曲菌（CICC No. 22937)浓度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10scfu/ml作为阳性 对照标准品，布氏肉汤为阴性对照标准品。
[0041] 2.单克隆抗体的制备过程
[0042] (1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0043] (2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射 一次。
[0044] (3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0045] (4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规 融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%C02培养箱培养。
[0046] (5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞， 将其转移至24孔培养板。
[0047] (6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2X106 个杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水 中纯化抗体。
[0048] 筛选出2株稳定分泌抗空肠弯曲菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457,简称H3)和 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766,简称G9)，经过初步抗 体配对实验后，对H3和G9进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克 隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
[0049] 3.单克隆抗体纯化及鉴定
[0050] 腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化； 纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价（见表1);再用SDS-PAGE分析纯度， 5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶 成像分析系统观察结果（见图 1 (Lanel:4C9ElG7H3,Lane3:3G2D8H3G9)) 〇
[0051] 表L两株单克隆抗体效价测定结果（〇D45。）
[0052]
[0053] 4.单克隆抗体的亚型鉴定
[0054] ⑴抗原包被：用0· 01MPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μ1，4°C包被过 夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。
[0055] (2)封闭：每孔加入1%BSA200μ1，4°C封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
[0056] (3)加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μ1。37°C，孵育 lh〇
[0057] ⑷洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3,IgA，IgM， κ，λ，37°C孵育lh。
[0058](5)洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)， 37°C，孵育 30min。
[0059](6)洗板4遍后，加入100μ1底物显色液，37°C，避光显色lOmin。于450nm波长 下读取结果。
[0060] 如表2所示，H3属于IgG2a亚类，G9属于IgGl亚类，轻链亚型均为κ。
[0061] 表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
[0062]
[0063] 5.单克隆抗体交叉反应的测定
[0064] (1)抗原包被：将96种10scfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病 菌加3各孔，每孔100μ1，4°C，包被过夜。
[0065] (2)封闭：洗板3遍后，每孔加入3%BSA200μ1，37°C孵育2h。
[0066] (3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μ1，37摄氏度孵育lh。
[0067] (4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μ1，37摄氏 度孵育lh。
[0068] (5)洗板4遍。加入底物显色液，37°C，避光显色15min。于450nm波长下读取结 果，结果见表4。
[0069] 表4.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] 实施例2胶体金试纸条抗体最优组合的确定
[0075] 1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
[0076] 分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、 7. 5、8. 0、8. 5、9. 0,每孔加入10yL浓度为lmg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入 10μL10%NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
[0077] 图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0。 由图2得知，A组为不同pH值下单克隆抗体H3胶体金标记的结果，当pH为7. 5-8. 0时， 孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即H3单抗偶联胶体金最佳pH范围为 7. 5-8. 0 ;B组为不同Ph值下单克隆抗体G9胶体金标记结果，当pH为7. 5时，胶体金颜色 最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即G9偶联胶体金最佳pH为7. 5。
[0078] 2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
[0079] 调节胶体金溶液pH至步骤（1)中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100yL于 96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10yL10%NaCl溶液，反应5min，观察 溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量X μg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+xX20%为最佳结合量。
[0080] 表5抗体与胶体金偶联最佳结合量
[0081]
[0082] 由图3得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10%NaCl后各组孔1中 胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。 当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变 深，其中，A组H3抗体添加量多lOyg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3,即H3 最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL;B组G9抗体添加量彡20μg/mL时， 颜色变化较小，且均红于孔3、4、5,即G9最佳结合量为24μg/mL。
[0083] 3.抗体的胶体金标记
[0084] 胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤⑵中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/ min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌 30min，加入金溶液1/10体积的含10%BSA的PBS溶液，搅拌lh，移入离心管4000rpm离心 lOmin，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原 胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4°C保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量 重悬，混合均匀后4°C保存备用，如需保存较长时间，可加入0. 3%叠氮化钠。
[0085] 4.空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的组装及测定
[0086] 图4是本实用新型空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
[0087] 如图4所示，空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、 检测线16,质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜 12,硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16,检测线16 靠近样品垫14 一侧。另外空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬（图中未显 示），用于承载上述的样品垫14等结构。
[0088] 将步骤3中制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为 H3-Au-pad、G9-Au-pad，将各抗体均稀释至lmg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Test line，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以