专利名称：稻瘟病菌生理小种单基因鉴别体系及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种稻瘟病菌生理小种的鉴别体系及其构建技术方法。
背景技术：
稻瘟病菌生理小种研究已有80多年历史，迄今有过10多套鉴别体系用于稻瘟病菌生理小种研究(凌忠专等著水稻抗稻瘟病育种，福建科学出版社，1990，pp55-59)。这些鉴别体系分为三类第一类是指20世纪50年代末至70年代初各国使用的鉴别体系，这一时期的鉴别体系都是由遗传学家、病理学家凭借自己的经验选定的，它们都包括籼、粳两种类型的品种，每个品种的遗传背景各不相同；没有对品种进行抗病基因分析，品种的抗病基因组成不清楚，生理小种鉴别力低。第二类是70年代中期至80年代初的鉴别体系，鉴别体系中的每个品种具有单个已知抗病基因。这套单基因鉴别体系的创建，在方法上屏弃了凭经验选择鉴别品种的做法，先用大量稻瘟病菌株对大量实用品种进行品种分类，然后选择代表性品种进行抗病基因分析，最后选择已知基因品种组成鉴别体系，但遗传背景依然不同。后来的研究证明这套‘单基因’鉴别体系也不是单基因鉴别体系，鉴别体系中的多个品种至少含有2个基因。第三类是近等基因系水平的鉴别体系，20世纪80年代中期，国际水稻研究所(IRRI)以感病品种C039为轮回亲本，与籼稻品种特特普及粳稻品种稗杆稻杂交，经过6次回交把抗病基因导入C039，育成4个近等基因系。但由于C039具有一个主效抗病基因Pi-a，IRRI培育的4个近等基因系因此而不具有真正单基因特性。IRRI和日本合作，利用我们提供的丽江新团黑谷(LTH)于2000年育成24个遗传背景相同的单基因系，但由于这些单基因系回交次数少和缺少小种鉴别力鉴定而不能直接用于新的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别体系的构建。
育成的近等基因系的真正单基因特性是构建适用于世界各稻区的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别体系的关键。而真正单基因特性的鉴定和验证方法的确立，是解决这一关键问题的核心技术。常规基因分析法只能分析某一品种对某一个或某几个稻瘟病菌株的抗性及控制这种抗性的基因组成，不能分析这个品种对所有被测定菌株的抗性及控制这种抗性的基因组成。因此，用常规方法无法证明某个品种(系)是否具有真正单基因特性。
由于不同抗病基因间的抗谱有明显差异，不是所有的单基因近等基因系都表现很强的稻瘟病菌生理小种鉴别力。因此，判定单基因近等基因系小种鉴别力强弱的量化技术指标的制定是构建新的单基因鉴别体系的又一技术关键。单基因近等基因系分为三类1)具有广抗谱抗病基因的单基因近等基因系；2)具有窄抗谱抗病基因的单基因近等基因系；3)具有中等抗谱抗病基因的单基因近等基因系。第1、2类单基因近等基因系的抗谱太宽或太窄，不能把致病性不同的稻瘟病菌株有效地区分开，因此，不能用于构建小种鉴别力最强的新鉴别体系。具有中等抗谱抗病基因的单基因近等基因系才能用于这种鉴别体系的构建。
综上所述，目前国际上还没有构建出可供统一使用的新一代单基因鉴别体系，其技术障碍是缺少真正单基因特性的验证方法和及判定单基因系统小种鉴别力强弱量化技术指标。
发明内容
本发明的目的是为解决在构建新一代单基因鉴别体系时存在的技术难题，提供一种构建技术方法和一套鉴别力强、适用范围广的稻瘟病菌生理小种新单基因鉴别体系本发明所提供的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，是以不具主效抗病基因的普感粳型地方品种丽江新团黑谷(LTH)作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH育成的单基因近等基因系。
为确保育成的近等基因系能够稳定遗传，所述回交进行6次。
所述单基因鉴别系统与LTH杂交的F2群体对非致病菌株表现单基因分离。
所述已知抗病基因来自于日本清泽鉴别品种草笛(Pi-k，Pi-sh)、梅雨明(Pi-km，Pi-sh)、K1(Pi-ta，Pi-x)、Pi4号(Pi-ta2，Pi-sh)、K60(Pi-kp，Pi-sh)和BL1(Pi-b，Pi-sh)。育成的新单基因近等基因系，即各鉴别系统只分别表现Pi-k、Pi-km、Pi-ta、Pi-ta2、Pi-kp、和Pi-b的抗性。
培育稻瘟病菌生理小种新单基因鉴别系统的方法，包括以下步骤1)利用普感粳型地方品LTH作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH中，得到近等基因系；2)鉴定和验证近等基因系的单基因特性；3)判定单基因近等基因系生理小种鉴别力，组建新的鉴别体系。
所述近等基因系单基因特性的鉴定方法为1)以育成近等基因系为母本与LTH杂交，用菌系对其F2代进行接种，分析该F2群体抗病基因组成，选定表现单基因分离的F2群体；2)保留并种植表现单基因分离的F2群体中出现的所有感病植株，并混合收获感病植株上的种子；3)用至少100个有代表性的稻瘟病菌株分别接种来自感病植株种子的水稻幼苗，如果幼苗对所有供试菌株仍然表现感病，则说明育成的系统是真正单基因的近等基因系。其中F2表现单基因分离是指抗∶感＝3∶1。
所述判定近等基因系生理小种鉴别力强弱的量化技术标准为抗病率在70％~30％之间。即以50％为中心，向两侧扩展一定的区间，单基因近等基因系的抗病百分率为50％时，稻瘟病菌生理小种的鉴别力最强。
Flor基因对基因学说认为当鉴别品种具有抗病基因，稻瘟病菌具有与抗病基因专性对应的非致病性基因，基因互作结果为鉴别品种表现抗病反应，稻瘟病菌表现非致病性反应时，用符号R表示。如果鉴别品种不具有抗病基因，如表1中的D品种，它对所有的分离菌都表现感病反应，或者鉴别品种具有抗病基因，但分离菌不具有与它专性对应的非致病性基因，则鉴别品种也表现感病反应，而稻瘟病菌表现致病性反应，用符号S表示。表1中的B品种(基因型A++)，尽管该品种具有A基因，但对表中的c菌系表现感病反应，因为c菌系中没有与抗病基因A相对应的非致病基因a.
表1.鉴别品种的基因型与稻瘟病菌基因型的相互作用品种 菌系(菌系基因型)(基因型)a(ab+)b(a++)c(+b+)d(+++)e(abc)f(a+c)g(+bc)h(++c)A(AB+)RRRSRRRSB(A++)RRSSRRSSC(+B+)RSRSRSRSD(+++)SSSSSSSSE(ABC)RRRSRRRRF(A+C)RRSSRRRRG(+BC)RSRSRRRRH(++C)SSSSRRRR单基因的鉴别品种的生理小种鉴别能力如表2所示。鉴别品种B、C、H的抗病基因型分别为A++、B++、C++，即它们含有1个抗病基因，根据鉴别品种与菌系互作表现的反应型，三个单基因的鉴别品种能把基因型不同的8种稻瘟病分离菌区分开来。因此，用单基因鉴别品种(系)鉴别生理小种时，不同的反应型反映了分离菌的不同基因型。在被测菌株数很多的情况下，相同的反应型也反应相同的基因型。
表2.单基因鉴别品种与不同基因型的稻瘟病菌系的相互作用品种菌系(菌系基因型)(基因型)a(ab+)b(a++)c(+b+)d(+++)e(abc)f(a+c)g(+bc)
h(++c)B(A++)RRSSRRSSC(+B+)RSRSRSRSH(++C)SSSSRRRR如果鉴别品种含有2对或3对抗病基因，则不可能把基因型不同的全部菌系区分开来，表3列示2对抗病基因或3对抗病基因的鉴别品种与具有8种不同基因型的8类分离菌的互作。表中菌系a、e、f和g等4个菌系对鉴别品种A、F、G和E表现非致病性反应，而鉴别品种表现抗病反应。因此，根据反应型不可能把基因型不同的a、e、f、g4个菌系区分开。结果8个基因型不同的菌系被划分为5个生理小种。因此相同的反应型中包含不同的基因型，2对基因或3对基因的鉴别品种不能准确划分分离菌生理小种。
表3.非单基因鉴别品种与不同基因型的稻瘟病菌系的相互作用品种 菌系(菌系基因型)(基因型) a(ab+)b(a++)c(+b+)d(+++)e(abc)f(a+c)g(+bc)h(++c)A(AB+)R RRSRRRSF(A+C)R RSSRRRRG(+BC)R SRSRRRRE(ABC)R RRSRRRR本发明的6个单基因近等基因系对菲律宾籼稻区分离菌鉴别能力强，划分小种多，而供体亲本清泽鉴别品种鉴别力弱，划分小种数少；其原因就在于本发明的6个近等基因系的各个系统只分别具有单基因Pi-k、Pi-km、Pi-ta、Pi-ta2、Pi-kp和Pi-b，而供体亲本除含有这些基因外，还有其他抗病基因草笛(Pi-k，Pi-sh)、梅雨明(Pi-km、Pi-sh)、K1(Pi-ta、Pi-x)、Pi4号(Pi-ta2、Pi-sh)、K60(Pi-kp、Pi-sh)和BL1(Pi-b、Pi-sh)。
表1中的D品种，不具主效抗病基因，不管对哪一种基因型的菌株都表现感病反应，本发明中用作轮回亲本的云南粳型地方品种LTH就是这样的普感品种。
表1中的品种A与E、B与F、C与G、对菌系a、b、c和d表现相同的反应型，尽管基因型为ABC、A+C和+BC的鉴别品种E、F和G都含有抗病基因C，但由于在上述菌系中不包含非致病性基因c，所以E、F和G品种只表现A基因和B基因的抗性，而C基因对这些菌系无效。因此，受鉴定菌系来源和基因型的限制，只用a、b、c和d这4种类型的菌系不可能发现E、F和G品种中的抗病基因C，虽然它在鉴别品种中客观存在着。随着所用鉴别菌系数量的扩大，原来某国家或地区不存在的菌系，可能在别的国家或地区发现，例如表1中的菌系e、f、g、h，它们都具有非致病性基因c。当这样的菌系接种A、B、C、E、F、G鉴别品种时，它们的相互作用如表4所示表4.新抗病基因的发现品种 菌系(基因型)(基因型)e(abc)f(a+c)g(+bc)h(++c)A(AB+)R R R SB(A++)R R S SC(+B+)R S R SE(ABC)R R R RF(A+C)R R R RG(+BC)R R R R根据表4的反应型能把鉴别品种A、B、C与E、F、G的基因型区分开，而且由此发现了E、F和G品种中的抗病基因C。原来根据反应型可能判断为单基因的鉴别品种，例如F和G，至此可以确认为二基因的品种。日本鉴别品种中的Pi-sh基因或其他对日本菌系无效而对菲律宾菌系表现高抗的抗病基因就是这样发现的。因此，日本的鉴别品种不是单基因鉴别品种。
如图1所示，为本发明单基因近等基因系的培育及鉴定流程图，其中基因Pi-b对特定菌系有效而Pi-sh对特定菌系无效。BBSHSH、bbshsh等为寄主基因型，其下方的字母为该基因型对鉴定菌系的抗(R)感(S)反应。
选用丽江新团黑谷(LTH)作为轮回亲本的依据是我国云南粳型地方品种LTH经全国稻瘟病科研协作组20多个省、市的30多个研究单位在籼、粳稻区广泛接种鉴定，20多年中，所有被测菌株都能侵染这个品种。1980～1982年和1994年，本发明的发明人在日本和菲律宾分别用日本粳稻区的200多个菌株及菲律宾籼稻区的80个具代表性的菌株接种LTH，没有发现非致病性菌株。2000和2002年分别用100个韩国菌株和322个来自中国南北方稻区的菌株接种LTH，也没有发现非致病性菌株，进一步证明了LTH的普感性，只有利用LTH这样的普感品种，才能创制出真正单基因的近等基因系。
应用本发明的方法创制出来的单基因近等基因系具有其他鉴别体系所不具有的优点1.具有共同的普感遗传背景，本发明创建的单基因鉴别体系是具有统一的普感遗传背景的鉴别体系。与其它遗传背景的鉴别体系相比，普感遗传背景就象一张白纸，避免了背景中抗病基因与导入基因的互作，而更重要的是保证了育成系统的真正单基因性质，是经过充分验证的国际上第一套真正单基因的、鉴别能力最强、能在全世界统一使用的理想鉴别体系。
2.具有真正单基因特性，利用本发明方法培育的近等基因系均经过抗病基因分析和真正单基因特性检验，并证明只具有一个抗病基因。
3、具有最高生理小种鉴别力，用本发明方法育成的近等基因系对籼、粳稻区的稻瘟病菌株均具有很强的小种鉴别力，克服了日本鉴别品种对籼稻区菌株、IRRI近等基因系对粳稻区菌株小种鉴别力弱的缺点。用本发明方法育成的近等基因系可在籼、粳不同类型的稻作区应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
图1为单基因近等基因系的培育及鉴定流程图具体实施方式
实施例16个单基因近等基因系的培育1987年以LTH为母本，与具有已知抗病基因的日本清泽鉴别品种草笛(Pi-k，Pi-sh)、梅雨明(Pi-km，Pi-sh)、K1(Pi-ta，Pi-x)、Pi4号(Pi-ta2，Pi-sh)、K60(Pi-kp，Pi-sh)和BL1(Pi-b，Pi-sh)等供体亲本杂交，1988年春获得F1种子。1988年夏天用菌株北1接种鉴定F1植株，选择抗病个体作母本，与LHT回交获得BC1F1种子。从1988年冬季起，连续回交和抗性鉴定。1991年获得BC6F1种子。1992年自交获得BC6F2种子。同年种植各组合的BC6F2种子，分单株收获BC6F3。1993年接种鉴定，筛选出BC6F3抗病株系72个。1994年用菲律宾菌系接种鉴定，筛选出F-80-1、F-98-7、F-124-1、F-128-1、F-129-1和F-145-2等6个近等基因系。1995年以6个近等基因系为母本与LTH杂交，获得F1种子。1996年获得F2种子。1997年获得感病植株并繁殖感病植株种子。1998年进行近等基因系真正单基因特性鉴定，确认得到了6个单基因近等基因系，它们只表现Pi-k、Pi-km、Pi-ta、Pi-ta2、Pi-kp、和Pi-b的抗性实施例2本发明6个近等基因系(NILs)的基因组成分析和单基因特性的验证6个供体亲本与6个近等基因系对菲律宾分离菌抗性反应，表现为1.供体亲本表现抗病反应，近等基因系表现抗病反应；2.供体亲本表现抗病反应，近等基因系表现感病反应；3.供体亲本表现感病反应，近等基因系表现感病反应。在所有的组合中从未发现供体亲本表现感病反应，近等基因系表现抗病反应的情况。由该结果可以看出，中国6个近等基因系只表现Pi-k、Pi-km、Pi-ta、Pi-ta2、Pi-kp、和Pi-b的抗性，而6个供体亲本除这些基因起作用外，还表现了Pi-sh或其他抗病基因的作用，因此供体亲本比近等基因系的抗谱宽，对大多数菌株表现抗病。这说明通过6次回交后，在近等基因系的遗传背景中排除了对菲律宾籼稻区稻瘟病菌株表现高抗而对日本菌株北1无效的Pi-sh或其他抗病基因。
为了证明本发明的6个近等基因系是真正的具有单个抗病基因的系统，即它们对所有非致病菌株都表现单基因抗性，1998年利用6个近等基因系与LTH杂交，2000年用菌株北1鉴定6个F2群体的抗病性分离，各群体的抗病性分离符合抗∶感＝3∶1的分离比率，说明6个近等基因系对北1都表现单基因抗性。此前由6个近等基因系与LTH杂交的F2群体中的感病植株组成感病系统(LTH NILs S)。用100个代表性菌株对6个近等基因系(LTH NILs R)和与其相对应的LTH NILs S进行抗性鉴定，结果表明，对LTH NILs R系统表现非致病性和致病性的所有菌株都对LTH NILs S系统表现致病性，这证实了6个近等基因系对全部非致病菌株都表现单基因抗性。由此可以得出结论，中国6个近等基因系是真正的单基因鉴别体系。
实施例3与供体的鉴别力比较分别用菲律宾的42个菌株、25个日本菌株和中国北方粳稻区的100个菌株接种6个近等基因系及其6个供体亲本。小种鉴别力比较结果如下表表5.小种鉴别力比较结果接种地点 接种菌株数 菌株来源 近等基因系 亲本鉴定的小种数 鉴定的小种数菲律宾42 国际水稻研究所15 3日 本25 日本农业研究中心 11 11中 国100 中国北方稻区 18 18这个结果说明，本发明6个近等基因系和6个供体亲本对中国北方稻区及日本的菌株划分具有同等的生理小种鉴别能力。但6个近等基因系对籼稻区稻瘟病菌的小种鉴别能力明显高于其供体亲本。
实施例4与日本清泽鉴别品种比较用菲律宾的20个菌株接种6个近等基因系和日本清泽的11个鉴别品种(爱知旭除外)，本发明近等基因系划分20个菌株为11个生理小种，清泽鉴别品种划分20个菌株为8个生理小种，这个结果说明清泽鉴别品种对菲律宾分离菌的小种鉴别能力非常低，而本发明6个近等基因系表现很强的小种鉴别能力。
实施例5与IRRI近等基因系比较IRRI的4个近等基因系是用于稻瘟病菌生理小种研究的国际上常用的近等基因系。鉴定的小种数随鉴别品种(系)数目的增加而增加，为了以相同系统数准确地比较本发明的6个近等基因系与IRRI的4个近等基因系的鉴别能力，将本发明6个近等基因系划分为两组，IRRI的4个近等基因系为第三组。用22个菲律宾菌株接种以上3组供试材料，结果如表6所示表6、近等基因系的比较结果菌株来源 菌株数中国近等基因系-1中国近等基因系-2IRRI近等基因系菲律宾22 8 8 7结果证明，本发明近等基因系对菲律宾稻瘟病菌小种的鉴别能力与IRRI近等基因系相近或稍强。但是，用代表不同致病谱的粳稻区菌系接种IRRI的近等基因系，它们表现高抗、抗和中抗。IRRI的近等基因系对粳稻区分离菌鉴别能力低。
上述研究结果说明，用本方法育成的近等基因系对籼、粳稻区的稻瘟病菌株均具有很强的小种鉴别力，克服了日本鉴别品种对籼稻区菌株、IRRI近等基因系对粳稻区菌株小种鉴别力弱的缺点。用本方法育成的近等基因系可在籼、粳不同类型的稻作区应用。
权利要求
1.稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，是以不具主效抗病基因的普感粳型地方品种丽江新团黑谷(LTH)作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH育成的单基因近等基因系。
2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，其特征在于所述回交进行6次；所述鉴别系统具有共同的普感遗传背景、真正单基因特性、高度的小种鉴别力和广泛适用性。
3.根据权利要求1所述的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，其特征在于所述单基因鉴别系统与LTH杂交的F2群体对非致病菌株表现单基因分离。
4.根据权利要求1所述的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，其特征在于所述已知抗病基因来自于日本清泽鉴别品种草笛(Pi-k，Pi-sh)、梅雨明(Pi-km，Pi-sh)、K1(Pi-ta，Pi-x)、Pi4号(Pi-ta2，Pi-sh)、K60(Pi-kp，Pi-sh)和BL1(Pi-b，Pi-sh)。
5.根据权利要求4所述的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，其特征在于所述鉴别系统表现Pi-k、Pi-km、Pi-ta、Pi-ta2、Pi-kp、和Pi-b的抗性。
6.创制稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统的方法，包括以下步骤1)利用普感粳型地方品种丽江新团黑谷(LTH)作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH中，得到近等基因系；2)鉴定近等基因系的单基因特性；3)判定近等基因系生理小种鉴别力，组建新的鉴别体系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述近等基因系单基因特性的鉴定方法为1)以育成近等基因系为母本与LTH杂交，用菌系对其F2代进行接种；2)保留并种植表现单基因分离的F2群体中出现的所有感病植株，并混合收获感病植株上的种子；3)用至少100个有代表性的稻瘟病菌株分别接种来自感病植株种子的水稻幼苗，若幼苗对所有供试菌株仍然表现感病，则说明育成的是近等基因系。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述F2表现单基因分离是指抗∶感＝3∶1。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的判定单基因近等基因系生理小种鉴别力强弱的技术标准是抗病率为70％～30％之间。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述单基因近等基因系最佳的小种鉴别力标准是抗病百分率为50％。
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟病菌生理小种单基因鉴别体系及其构建方法，目的是提供一种鉴别力高、适用范围广的稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统及该系统的培育方法。稻瘟病菌生理小种单基因鉴别系统，是以不具主效抗病基因的普感粳型地方品种丽江新团黑谷(LTH)作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH育成的单基因近等基因系。构建稻瘟病菌生理小种单基因鉴别体系的方法，包括以下步骤1)利用粳型地方品种LTH作为轮回亲本，通过杂交、回交将已知抗病基因导入LTH中，得到近等基因系；2)鉴定并确认近等基因系的单基因特性；3)判定近等基因系生理小种鉴别力，组建新的鉴别体系。应用本方法创制的单基因近等基因系具有共同的普感遗传背景、真正单基因特性和很高的生理小种鉴别力、适用于世界各稻区。
文档编号A01H1/02GK1526272SQ0310510
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月3日 优先权日2003年3月3日
发明者凌忠专, 王久林, 雷财林, 潘庆华, 蒋琬如 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所