专利名称：一种多效微生物饲料添加剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物饲料添加剂及其制备方法，尤其适用作禽畜、水产动物的饲料添加剂。
背景技术：
抗生素作为饲料添加剂使用已有50年的历史，为动物的生长和健康做出了巨大贡献，是目前饲料中用量最大、最广的添加剂之一。自1975年日本最早报道病原菌抗药性现象以来，人们发现，由于大量和滥用抗生素已给动物本身、动物产品和环境带来一系列的问题。主要表现在，动物病原菌产生抗药性，导致抗生素用量的增加，引起内源性感染和二重感染。特别是长期使用会造成消化道内本身微生态失调和环境的污染。同时抗生素在产品中的残留还直接影响人类的免疫和健康。饲料微生物添加剂因具有安全、环保、无副作用和抗病、促生长等特点，而受到广大学者的重视，并已从微生态学理论、作用机理、菌种的筛选及应用等多方面进行了大量的研究，取得了可喜的成果。作为抗生素类添加剂的替代品，饲料微生物添加剂在国内外都已得到广泛的应用，取得了非常理想的效果，是最有前途的饲料添加剂之一。饲料微生物添加剂属于微生态制剂或益生素的范畴。其研制开发以动物微生态学(包括微生态平衡理论，微生态失调理论，微生态营养理论和微生态防治理论)为理论依据。饲料微生物添加剂是指摄入动物体内参与肠内微生物平衡的活性微生物培养物，它能通过直接增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，并间接起到促进动物生长和提高饲料转化率的作用。众多实验证实了具有提高增重、改善饲料转化效率、促进畜禽机体免疫功能、降低死亡率及改善环境等效果。如提高肉鸡成活率、增重及饲料效率；改善蛋鸡生存环境，提高产蛋性能和蛋的品质；提高仔猪成活率和生长速度，有效防止仔猪腹泻；提高生育肥猪日增重，在母猪日粮中添加可使断奶仔猪数和断奶体重显著提高。在水产养殖上，微生物饲料添加剂能提高罗氏对虾幼苗的成活率，增强成虾、大西洋鲑对病原菌的抵抗力；而且添加剂中的光合细菌和化能异养菌能够降解进入养殖池塘中的各种有机废物，消除有毒因子，稳定pH值，平衡菌相与藻相，营造良好的水生环境，达到预防疾病、健康养殖的效果。目前使用的益生素主要是芽孢杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌等单一菌种或复合菌种的制剂。
微生物饲料添加剂采用的菌种主要有乳酸菌类(Lacticacid bacteria)、酵母菌类(Yeasts)和芽孢杆菌类(Bacillus)。
用于饲料添加剂的芽孢杆菌是一种需氧的非致病菌。它在肠道或贮藏过程中都以内生子的形式存在，不消耗饲料养分，可保持饲料的质量。进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近100％。它能使空肠内的pH值下降，氨浓度降低，并消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制病菌的生长，维持肠道正常生态平衡，并有平衡和稳定乳酸菌的作用。它能产生活性很高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸。芽孢杆菌抗逆性强，具有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特点，可耐受颗粒饲料加工的影响。
乳酸菌类是一种可以分解糖类产生乳酸的无芽孢革兰氏阳性菌，可以厌氧、兼性厌氧生长。乳酸菌在饲料添加剂中具有重要的地位，在美国FAD(1989)公布的40多种饲用微生物中有近30种是乳酸菌。它耐酸，在pH为3.0～4.5时仍可生长，适应于胃肠的酸性环境。乳酸菌是鱼肠道的正常菌群，在鱼体肠道系统定植，在体内通过生物拮抗，拮抗革兰氏阴性致病菌，维持肠道中正常的生态平衡，可降低肠道pH值，阻止和抑制有害物质，增强抗感染能力。活菌体内和代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶(SOD)，能增强动物的体液免疫和细胞免疫，增强机体的免疫调节活性，促进生长。但该类菌在生长过程中，不形成芽孢，抗逆性差，易失活，难保藏，所以在饲料工业中的应用受到一定的限制。目前有些市售产品采用微胶囊包被技术，提高了其对环境的抗逆性，但生产成本也相应提高。
酵母菌是喜生长在偏酸性环境的需氧菌，在肠道内大量繁殖。在水产业中可以使用从鱼体、水体分离到的酵母，主要有假丝酵母属(Candida)等。饲料中也可以使用酿造酵母(Brewer’s yeast)和面包酵母(Baker’s yeast)。
发明内容
本发明的目的在于开发一种性能更优越的微生物饲料添加剂及其制备方法。
本发明利用乳酸芽孢杆菌除了具有普通乳酸菌共同的种种有益特性外，还兼有芽孢杆菌的特性，通过特殊的发酵培养制备出含乳酸芽孢杆菌菌数高、芽孢形成率高的发酵液作为饲料添加剂，性能优于现有的微生物饲料添加剂从而实现了本发明的目的。
本发明多效微生物饲料添加剂的技术特征在于含有由下述制备方法得到的含有乳酸芽孢杆菌的发酵液，所述的制备方法包括如下几个步骤(a)斜面菌种活化将保藏斜面种乳酸芽孢杆菌分别划线于斜面种培养基上进行活化，所述的斜面种培养基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，琼脂18～22g/L，其余为水，pH7.0～7.2，常规方法灭菌；(b)菌种的一级液体活化将上述培养好的斜面种用接种环分别接种于一级液体培养基中进行培养，使液体种的菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一级液体培养基中含蛋白胨15.0～25g/L， 酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，钙盐5.0～15g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，锰盐0.01～0.1g/L，pH7.0～7.5，其余为水，常规方法灭菌；
(c)种子罐中的培养将上述分别培养好的一级液体种摇匀后在无菌条件下按体积分数1％～5％接种量接入种子罐的培养基中，通气培养24～48h，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培养；(d)大发酵罐中的培养将上述分别培养好的乳酸芽孢杆菌种按体积分数10％～20％的接种量接入发酵罐的培养基中进行培养，温度37～42℃，转速180～250r/min，按每m3培养基的空气为20～30m3/h进行通气培养48～60h，发酵16～40h后开始补加已灭菌的葡萄糖浓缩液，总补加量为体积分数1％～4％，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止发酵培养；(c)和(d)步骤中所述的培养基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，钙盐5.0～15.0g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，锰盐0.01～0.1g/L，其余为水，pH7.0～7.5，常规方法灭菌。
(b)、(c)和(d)步骤中所述的钙盐可以是碳酸钙、硫酸钙、硝酸钙等，最好是碳酸钙，所述的锰盐可以是硫酸锰、氯化锰、硝酸锰等，最好是硫酸锰。
本发明多效微生物饲料添加剂中最好还含有质量分数2％矿石粉、质量分数2％沸石粉、质量分数2％膨润土、质量分数5％柠檬酸。
本发明所用的乳酸芽孢杆菌也叫凝结芽孢杆菌，菌号为Bacillus coagulansAB92064，保藏于CCTCC，中国典型培养物保藏中心。这个菌种在《中国典型培养物保藏中心培养物目录》(陶天申.武汉大学，1998.25.)上公开记载。
本发明多效微生物饲料添加剂的制备方法包括上述(a)、(b)、(c)和(d)步骤。
本发明多效微生物饲料添加剂的制备方法最好在(d)步骤产生的成熟的发酵液中添加质量分数2％矿石粉、质量分数2％沸石粉、质量分数2％膨润土、质量分数5％柠檬酸，搅拌、混合均匀，即制成多效微生物饲料添加剂。
这种多效微生物饲料添加剂可以按质量分数1％～3％的比例与饲料或饵料混合，用于喂养动物，增加饲养动物对饲料的吸收和提高饲养动物的抗病能力。
本发明具有如下优点。
1、本发明所用的乳酸芽孢杆菌作为理想的微生物添加剂的菌种具备如下特性(1)有良好的安全性，所用菌种不会使人和动物致病，不与病原微生物在自然条件下产生杂交种；(2)易于培养，繁殖速度快；(3)有良好的定植能力，在低pH值和胆汁中可以存活，并能植入肠粘膜；(4)在发酵过程中能产生酸和过氧化氢等物质；(5)能合成对大肠杆菌、弧菌、气单胞菌等水产动物肠道致病菌的抑制物而不影响自己的活性，有利于促进宿主的生长发育及提高抗病能力；(6)在整个制备和保存过程中能保持生命活力，混入饲料后稳定性好；2、本发明加入的膨润土、沸石粉等含有大量的微量矿物元素，它可以对饲养动物发挥以下作用(1)对免疫器官和免疫细胞的直接作用；(2)辅助因子的作用；(3)抑菌作用；(4)微量矿物元素作为免疫增强剂的作用、微量矿物元素的抗氧化与防衰老作用、微量矿物元素参与补体反应、微量矿物元素可减轻应激反应。
3、因为动物胃为酸性环境，其中的细菌多为产酸菌和耐酸菌，幼年动物分泌胃酸能力较弱，而使外来菌容易存活和繁殖。本发明加入的柠檬酸作为酸化剂可以提高胃液酸性，促进乳酸芽孢杆菌、乳酸菌等耐酸菌大繁殖，使之在胃中保持优势菌的地位，而大肠杆菌等外来菌则不能适应酸性环境，并受到乳酸菌等的“排挤”而不能定植存活，因此可以降低动物病理性腹泻的发生率。酸化剂还能帮助机调整免疫系统反应，增强家禽的抗病力。
4、本发明的制备方法使发酵液中的乳酸芽孢杆菌菌数达1.0×109CFU/mL以上，芽孢形成率在70％以上。由于芽孢形成率高，使得乳酸芽孢杆菌AB92064能顺利穿过胃部而定植于肠道，乳酸芽孢杆菌除具有普通乳酸菌共同的种种有益特性外，还兼有芽孢杆菌的特性，在抗干燥，抗高温，抗酸度方面优于普通乳酸菌，因此可在肠道内大量定植。该菌对饲养动物胃肠道具有明显的调理功能，能增加饲养动物对饲料的吸收和提高饲养动物的抗病能力。
具体实施例方式
实施例1用2m3发酵罐生产多效微生物饲料添加剂包括以几个步骤(a)斜面菌种活化用接种针将保藏的菌种乳酸芽孢杆菌AB92064接种一环划线于新配制的斜面种培养基上，斜面种培养基的化学组成如下(g/L)蛋白胨15.0，酵母膏5.0，葡萄糖10.0，琼脂20，其余为水，pH7.0；每个种各接支，于40℃培养48小时；(b)菌种的一级液体培养将培养好的斜面种用接种环分别接种一环于一级液体活化培养基中，一级液体培养基化学组成如下(g/L)蛋白胨20.0，酵母膏10.0，葡萄糖20.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，pH7.2；培养基装于1000mL三角瓶中，三角瓶装量为40mL，每个种各接4瓶，于40℃往复式摇床振荡培养36～48小时，摇床转速为120r/min，冲程为75mm，使液体种的菌数达1.0×109CFU/mL以上；(c)250L种子罐中的培养将上述分别培养好的一级液体种摇匀后在无菌条件下混合在一个无菌1L的接中瓶中，然后接入种子罐进行培养，种子罐培养基的化学组成如下(g/L)蛋白胨25.0，酵母膏10.0，葡萄糖40.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，其余为水，pH7.2；250L种子罐装160L培养基，38℃，转速200r/min，风量为2m3/h，进行通气培养，保持罐压0.1MPa，待菌数达1.0×109CFU/mL以上，停止培养；(d)2m3大发酵罐中的培养将上述分别培养好的种160L接入装有已消毒好培养基的大发酵罐中进行培养，发酵培养基组分(g/L)蛋白胨25.0，酵母膏10.0，葡萄糖40.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，其余为水，pH7.2；2m3大发酵罐装1300L培养基，38～40℃，转速220r/min，风量为空气140m3/h，发酵24小时，补加500g/L无菌葡萄糖液28L，发酵48小时，再补加500g/L无菌葡萄糖液28L，待菌浓度达1.0×109CFU/mL以上，停止发酵培养；(e)制成成品停止发酵培养后，首先关闭通风管，关掉搅拌电机，打开人孔，加入矿石粉28公斤、沸石粉28公斤、膨润土28公斤、柠檬酸70L；再盖上人孔，打开搅拌电机，以160r/min充分搅拌10分钟，降低搅拌转速至80r/min，开始放罐，用2条软管直接、快速放入不同体积的包装罐中，即制成成品。
实施例2产品应用效果试验实施例1制成的多效微生物饲料添加剂，进行对鲤鱼和草鱼进行应用试验，结果如下15～17g鲤鱼鱼苗饵料内加入质量分数0.1％本发明的鱼微生物添加剂组，其尾均增重率和成活率分别较对照组多8.5％和14.1％；尾重49～53g鲤鱼，饲料中加入质量分数0.1％本发明的鱼微生物添加剂组，其尾均增重率较对照组多8.64％；尾重51～61g的鲤鱼与尾重98～116g的草鱼混养，饵料内加入质量分数0.1％本发明的鱼微生物添加剂组鲤鱼尾均增重率和成活率较对照组分别多14.5％和8.5％，草鱼尾均增重率和成活率较对照组分别多30.2％和44.6％；对高、中、低三个饵料营养水平比较试验，以消化能3800大卡/公斤和粗蛋白32％的中营养水平组的尾均增重率最好，较高营养水平组多31％，比低营养水平组多0.13％；作为猪饲料的添加剂喂养苗猪，有效地防治仔猪黄白痢，降低腹泻频率65％以上，提高仔猪饮料转化率16％，日增重提高21％。在生长肥育猪全期使用时，平均日增重至少可达780g以上，比对照组提高15％以上；作为鸡饲料的添加剂喂养蛋鸡和肉鸡，可使蛋鸡产蛋率提高15％～20％左右，可使肉鸡同期增重约8％，提高苗鸡的成活率，缩短饲养周期，提前出栏，降低料肉比；而作为鱼虾的饲料添加剂，可使对虾成苗率提高30％左右。结果表明乳酸芽孢杆菌作为微生物添加剂具有安全性，并能促进生长、提高饵料利用率和养殖成活率，而且在中或低等营养水平的饲料中添加多效微生物饲料添加剂的作用表现得更加明显，效果优于高营养水平，因此本发明是一种理想的饲料添加剂。
权利要求
1.一种多效微生物饲料添加剂，其特征在于含有由下述制备方法得到的含有乳酸芽孢杆菌的发酵液，所述的制备方法包括如下几个步骤(a)斜面菌种活化将保藏斜面种乳酸芽孢杆菌分别划线于斜面种培养基上进行活化，所述的斜面种培养基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，琼脂18～22g/L，其余为水，pH 7.0～7.2，常规方法灭菌；(b)菌种的一级液体活化将上述培养好的斜面种用接种环分别接种于一级液体培养基中进行培养，使液体种的菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一级液体培养基中含蛋白胨15.0～25g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，钙盐5.0～15g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，锰盐0.01～0.1g/L，pH 7.0～7.5，其余为水，常规方法灭菌；(c)种子罐中的培养将上述分别培养好的一级液体种摇匀后在无菌条件下按体积分数1％～5％接种量接入种子罐的培养基中，通气培养24～48h，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培养；(d)大发酵罐中的培养将上述分别培养好的乳酸芽孢杆菌种按体积分数10％～20％的接种量接入发酵罐的培养基中进行培养，温度37～42℃，转速180～250r/min，按每m3培养基的空气为20～30m3/h进行通气培养48～60h，发酵16～40h后开始补加已灭菌的葡萄糖浓缩液，总补加量为体积分数1％～4％，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止发酵培养；所述的(c)和(d)步骤中所述的培养基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，钙盐5.0～15.0g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，锰盐0.01～0.1g/L，其余为水，pH 7.0～7.5，常规方法灭菌。
2.一种多效微生物饲料添加剂，其特征在于所述的钙盐是碳酸钙，所述的锰盐是硫酸锰。
3.根据权利要求1，2所述的一种多效微生物饲料添加剂，其特征在于含有质量分数2％矿石粉、质量分数2％沸石粉、质量分数2％膨润土、质量分数5％柠檬酸。
4.一种多效微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括如下的几个步骤(a)斜面菌种活化将保藏斜面种乳酸芽孢杆菌分别划线于斜面种培养基上进行活化，所述的斜面种培养基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，琼脂18～22g/L，其余为水，pH 7.0～7.2，常规方法灭菌；(b)菌种的一级液体活化将上述培养好的斜面种用接种环分别接种于一级液体培养基中进行培养，使液体种的菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一级液体培养基中含蛋白胨15.0～25g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，钙盐5.0～15g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，锰盐0.01～0.1g/L，pH 7.0～7.5，其余为水，常规方法灭菌；(c)种子罐中的培养将上述分别培养好的一级液体种摇匀后在无菌条件下按体积分数1％～5％接种量接入种子罐的培养基中，通气培养24～48h，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培养；(d)大发酵罐中的培养将上述分别培养好的乳酸芽孢杆菌种按体积分数10％～20％的接种量接入发酵罐的培养基中进行培养，温度37～42℃，转速180～250r/min，按每m3培养基的空气为20～30m3/h进行通气培养48～60h，发酵16～40h后开始补加已灭菌的葡萄糖浓缩液，总补加量为体积分数1％～4％，待菌数达1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止发酵培养；所述的(c)和(d)步骤中所述的培养基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米浆5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，钙盐5.0～15.0g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，锰盐0.01～0.1g/L，其余为水，pH 7.0～7.5，常规方法灭菌。
5.一种多效微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的钙盐是碳酸钙，所述的锰盐是硫酸锰。
6.根据权利要求4，5所述的一种多效微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于在所述的(d)步骤产生的成熟的发酵液中添加质量分数2％矿石粉、质量分数2％沸石粉、质量分数2％膨润土、质量分数5％柠檬酸，搅拌、混合均匀，即制成多效微生物饲料添加剂。
全文摘要
本发明涉及一种微生物饲料添加剂及其制备方法。其特征在于利用乳酸芽孢杆菌除了具有普通乳酸菌共同的种种有益特性外，还兼有芽孢杆菌的特性，通过特殊的发酵培养制备出含乳酸芽孢杆菌菌数高、芽孢形成率高的发酵液作为饲料添加剂。该添加剂对饲养动物胃肠道具有明显的调理功能，能增加饲养动物对饲料的吸收和提高饲养动物的抗病能力，尤其适用作禽畜、水产动物的饲料添加剂。
文档编号A23K1/16GK1579200SQ0314002
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月1日 优先权日2003年8月1日
发明者施庆珊, 许虹, 林小平, 吴家俊, 李良秋, 邱玉棠 申请人:广东省微生物研究所