专利名称：阿维菌素高产高分泌率生产菌种及avm提取新方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产阿维菌素的新型生产菌种，以及与之配套的新的阿维菌素发酵生产和提取的方法。
背景技术：
阿维菌素(avermectin，AVM)是一类由链霉菌发酵获得的大环内酯类抗生素。它包括8个结构很接近的化学组份，分别称为AVMA1a、AVMA1b、AVMA2a、AVMA2b、AVMB2a、AVMB2b。在这8个组份中，AVMB1a的杀虫杀螨活性最强。因此，国内外阿维菌素产品目前都是AVMB1a的产品。AVMB1a对农林业上绝大多数害螨和害虫的杀灭活性比一般化学农药高出几倍到几十倍，田间使用剂量仅为每亩0.015克到1.5克。该抗生素对大多数种类的有益昆虫安全，在植物中残留时间很短，并且在土壤中很快被微生物分解为无毒物质。目前阿维菌素被公认为是一种安全有效的微生物源杀虫剂。
阿维菌素产生菌在菌细胞生长到一定阶段后才大量合成阿维菌素，合成出来的AVM几乎全部积累在菌丝细胞中，不释放到细胞外(我们称其为非分泌型菌种)，回收阿维菌素必须先以板框压滤等方法将成熟的菌丝体收集起来，然后用大量的有机溶剂(如丙酮、乙醇等)抽提。然而，大量地使用有机溶剂不仅增加了生产成本，而且对生产工人的身体健康、劳动环境和环境保护均带来了不利的影响。
专利文献CN1294197A中公开了一种通过使用少量有机溶剂来降低成本的发酵生产阿维菌素的新工艺，该工艺是建立在分泌型AVM产生菌菌株CCTCC NOM200028的基础上的，但是M200028菌株发酵单位较低，仅不到1500mgAVMB1a/L发酵液。
近几年来，由于各种因素导致的各种疾病越来越多，因此“食疗”和“饮疗”也普遍受到了人们的重视，市场上也出现了不少具有各种医疗效果的保健茶面市，如“绞股蓝”茶、“苦丁”茶等等。但无一例外的都是在普通的茶叶中加入某一种中药，从而使其达到具有治疗某种疾病的目的，但是各种的中药材混合后口感都不是很好。
发明内容本发明就是针对普通的保健茶的特点开发了一种野生甜茶的制备方法。
本发明的具体实施步骤是首先将野生甜茶干叶用115-125℃蒸气杀青3-7分钟后烘干、粗破碎、筛选去梗，再用95-105℃蒸气蒸6-10分钟固本，烘干5-8成，再用蒸气锅炒干，将所得的粗叶破碎为颗粒状，筛选出细叶梗和粉末再次用95-105℃蒸气蒸3-7分钟进一步固本，晾干6-8成，再用蒸气锅炒干，最后再依据响应的本领域常见技术制成袋泡茶、颗粒茶和条形茶。
本申请发明人经过深入研究，对M200028菌株进行进一步的诱变筛选得到了一些阿维菌素的高产高分泌型菌株，并将突变菌株用于工业生产，得到了相应的发酵和提取新方法。
本发明的目的在于提供由M200028菌株经紫外线和亚硝基胍诱变与筛选得到的阿维菌素高产高分泌率突变菌株。
本发明进一步的目的是提供一种通过阿维菌素高产高分泌率突变菌株发酵来生产阿维菌素的新方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用简单的五步提取法提取阿维菌素的新方法本发明的阿维菌素高产高分泌率突变菌株属于除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，是以除虫链霉菌LAF-108(CCTCC NOM200028)菌株出发，经反复紫外线和亚硝基胍诱变育种获得的，具体过程如下1、LAF-108菌株斜面菌种准备配制麦芽粉淀粉无机盐琼脂培养基(配方为大麦芽粉5克、淀粉18克、酵母浸入物2克、硝酸钾1克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、氯化钴0.005克、水1000ml、琼脂20-25g、pH7.0-7.2、分装试管和三角瓶。121℃蒸汽灭菌30分钟，待温度降至60℃左右时摆斜面，28-30℃温箱中预培养2-3天，然后划线接种LAF-108，27-28℃恒温培养5-7天。
2、诱变与筛选2.1紫外诱变与筛选2.1.1单孢子悬液制备将已经变灰的LAF-108菌株斜面菌种，用10-12ml灭过菌的生理盐水将孢子小心地洗下来，转移到一个装有20-50粒玻璃珠的250ml无菌三角瓶中，塞好棉塞后在摇床上振摇30分钟，使孢子充分打散。再加入约20ml无菌生理盐水，混匀。然后用单孢子过滤器过滤得到单孢子悬液。离心收集单孢子，再悬浮于上述无菌生理盐水中，调整孢子浓度为1×107个/ml。
2.1.2紫外线诱变处理将上述单孢子悬液分装在小培养皿中，用紫外灯照射，分别照射60秒、90秒和120秒，全部操作在暗室内红光下进行。照射时开动电磁搅拌器。UV照射后的孢子悬液适当稀释后涂布分离平板。
2.1.3筛选在分离平板上挑选正面菌苔厚实、背面深褐的馒头形菌落。每个菌落编好号后再转接斜面培养基，同时密集划线涂一专门的琼脂平板，10天后用打孔器打菌块，浸于甲醇中泡24小时，以HPLC法测定各菌株浸提液中阿维菌素效价。按此法初筛，淘汰70％以上的产素量低的菌株。复筛和终筛采用摇瓶发酵法，以HPLC测各菌株发酵上清液中AVMB1a的浓度和发酵原液中阿维菌素AVMB1a的总浓度。经过初筛、复筛和终筛，最后选定HF-12菌株进行亚硝基胍(NTG)诱变育种。
2.2亚硝基胍(NTG)诱变与筛选2.2.1单孢子悬液制备用经过过滤除菌的0.1mol/LTris与0.1mol/L顺丁烯二酸等量混合之pH为8.0的缓冲液洗下HF-12菌株孢子，并将此孢子悬液倒入无菌三角瓶(内装玻璃珠30-40粒)中。在摇床上振摇30分钟左右，通过无菌的单孢子过滤器过滤获得单孢子悬液。离心收集单孢子，重悬浮于上述pH8.0缓冲液中，调整孢子浓度至108个/ml。
2.2.2亚硝基胍(NTG)诱变处理将上述单孢子悬液加入亚硝基胍溶液中，使亚硝基胍的最终浓度为1.0mg/ml。室温下诱变处理60分钟。马上离心除去亚硝基胍，再用无菌水反复离心洗涤孢子3次后离心收集备用。
2.2.3分离和筛选制备麦芽粉淀粉无机盐琼脂平板。按常规稀释平板法分离单菌落。筛选方法同“2.1.3”所述。筛选得到5株阿维菌素发酵效价高且分泌率也较高的除虫链霉菌菌株AVHF-66、AVHF-31、AVHF-49、AVHF-27和AVHF-61，将突变菌株制成甘油管保藏。上述突变菌株的发酵效价可以达到5200μg/ml(AVMB1a)，比已在专利文献CN1294197A中公开的LAF-108菌株的发酵效价高出约3倍。
这些菌株能够将其合成的阿维菌素分泌到细胞外，分泌率高达60％-95％。分泌出来的阿维菌素以一种蜡质小球的形式悬浮在发酵液中，在干的球状物中阿维菌素(AVMB1a)的含量约为20％，这极大地提高了阿维菌素的产率并降低了提取成本。
其中除虫链霉菌AVHF-66和AVHF-31菌株已于2004年9月9日在国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(武汉)保藏，保藏号分别为CCTCC NOM204069，CCTCC NOM204070。
可以采用生产阿维菌素的常规培养基和常规的发酵条件来将本发明的菌株用于分批发酵、半连续发酵或连续发酵，即可以实现不断流加营养物和不断排放蜡质球状物的生产方式。而本发明的这些分批、半连续或连续发酵只需在现有分批发酵工艺设备的基础上对设备进行局部改造便可以实现。
在使用本发明菌株进行的分批发酵中，发酵结束后用简单的机械方法就可以将上述球状物分离出，再用少量有机溶剂溶解，浓缩和结晶即可获得高纯度的阿维菌素产品。其中有机溶剂的使用量不到现行阿维菌素生产工艺有机溶剂使用量的15％。
使用本发明的菌株无论是进行分批发酵还是半连续或连续发酵都可以大幅度地降低有机溶剂的用量，这样不仅可以降低提炼成本，而且还有利于生产工人的身体健康、劳动安全和环境保护。另外利用本发明的菌种进行AVM连续或半连续发酵也大大提高了设备使用率和发酵的生产效率。
可以采用以下过程进行本发明菌株的分批、半连续或连续发酵。
分批发酵按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方配制茄子瓶斜面。预培养后，若未发现杂菌生长则接种上述5株除虫链霉菌中的任意一株。于27-29℃恒温箱中培养5-7天，待孢子成熟后收存于冰箱中供发酵用。
种子罐投料系数为60-70％。种子培养基成份为淀粉2-4％，豆饼粉0.5-1.5％，花生饼粉0.6-1.2％，活性干酵母粉0.3-0.7％，玉米浆0.3-0.5％，氯化钴0.0003-0.0015％，消泡剂0.02-0.04％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7.1-7.3。蒸汽灭菌121℃，30分钟。待培养基冷却至28℃左右后接种上述的斜面孢子悬浮液。接种量为每100L种子培养液1-2个茄子瓶斜面菌种。在通气量1∶0.5-1.0，26-28℃，200-400转/分搅拌培养12-36小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝情况下移种至发酵罐[此为2级发酵工艺，若发酵罐体积在50立方米以上，则可以再增加一级种子培养(即三级发酵工艺)，培养基的成份和培养条件同上]。
发酵罐中发酵培养基的组成是淀粉6-10％，活性干酵母粉1.0-1.4％，豆饼粉0.5-2.0％，玉米粉0.5-1.2％，氯化钾0.2-0.6％，磷酸二氢钾0.03-0.05％，氯化钴4-6μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.03-0.05％，碳酸钙0.1-0.3％，耐高温淀粉酶0.004-0.01％，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0.01-0.05％，用自来水定容至所需体积，消前pH6.8-7.0。经蒸汽灭菌后接种，接种量为2-10％，在料温27-29℃，通气量1∶0.8-1.15，搅拌速度150-350转/分条件下培养9-10天，pH上升至7.5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开放罐阀门，放出全部发酵液，用湿筛机械(筛网为40-80目)筛取发酵罐中的AVM小球，球状物在离心甩干后进入提取罐，用2-4倍体积甲苯(或乙酸乙酯)溶解，活性碳脱色，无水硫酸钠脱水，脱色液浓缩，最后加入AVMB1a晶种得到AVMB1a结晶。
半连续发酵如专利文献CN1294197A所述，在发酵罐圆柱体侧面高约65-75％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门，以便排放发酵液中的AVM球状物，并可以通蒸汽进行灭菌。
斜面菌种准备和种子液制备的过程同以上分批发酵所述。半连续发酵的发酵培养基组成可以是淀粉6-10％，活性干酵母粉1.0-1.4％，玉米粉0.5-1.5％，豆饼粉0.5-2.0％，玉米浆0.2-1.0％，氯化钾0.2-0.6％，磷酸二氢钾0.03-0.06％，氯化钴4-6μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.03-0.05％，碳酸钙0.1-0.3％，耐高温淀粉酶0.004-0.01％，并加入泡敌和植物油的混合消泡剂0.01-0.05％，用自来水定容至所需体积，消前pH6.8-7.2。在130-150℃蒸汽连消灭菌后降温并进入发酵罐接种。接种量为2-10％，在料温27-28℃，通气量1∶1-1.15，搅拌速度150-350转/分条件下发酵培养。发酵进行至120小时后，每隔4-8小时检测一次发酵液中的总糖、还原糖、氨基态氮和阿维菌素B1a组分含量。当还原糖低于1％时开始补糖。所补充的营养液配方为葡萄糖5-30％、植物油(优选为豆油和花生油)1-10％。从第9天开始每6-8小时镜检菌丝衰老与否。若有衰老现象则在流加营养液中增加适量的酵母浸提物。从第9天开始每次取样检测发酵液上层含球状物部分AVM1a含量，阿维菌素B1a组分含量高于2000μg/ml，则短时间停止搅拌和通气，同时打开上述排放孔阀门，排出发酵液上层的含素液。每次放出的发酵液体积和补充的新鲜培养液的量相当于原发酵液体积的5-10％。
通过补料，补充新鲜培养基和适当调整发酵条件，尽量延长以上发酵过程，提高阿维菌素总产量。每次从上排放孔排出的发酵液经过湿筛机收获AVM1a小球，甩干后进入提取罐，用2-4倍体积的甲苯或乙酸乙酯进行溶解，溶液滤清并脱水后浓缩1-2倍加入AVMB1a晶种，得到阿维菌素结晶。
经过若干天后，生产菌株不可避免地出现衰老自溶，如果菌丝明显衰老自溶，则可放罐。放罐后AVMB1a提取方法为下面将要叙述的五步法。
连续发酵按照两个或多个等容积(或不同容积)发酵罐串联的连续发酵工艺进行设备改造。在发酵罐圆柱体侧面高约65-75％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。2号罐以后各罐上设补料口，在排放孔安装相应的管道阀门。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方配制茄子瓶或试管斜面。预培养3天后，若未发现杂菌生长则接种上述5株除虫链霉菌中的任意一株。于27-29℃恒温箱中培养5-7天，待孢子成熟后取出，贮存于4℃冰箱中。上罐前用摇瓶方式进行考种，确证菌种无杂菌污染之后用于发酵生产。
液体种子的培养基配方同分批发酵所述，发酵培养基与半连续发酵培养基相同。发酵培养基通过连续灭菌系统灭菌，将温度降至28-30℃后贮存于发酵培养基贮罐内。
连续发酵工艺中采用的稀释度范围为0.005-0.03(1/h)，串联罐数为3或4个，容积比1∶1∶1(或1∶1∶1∶1)。温度1号罐和2号罐为27-28℃，3号罐(或3号罐和4号罐)为26-27℃；pH1号罐为6.4-6.8，2号罐(或2号罐和3号罐)为5.6-6.5，3号罐(或3号罐和4号罐)为6.0-6.8；风量1号罐为1∶1.0-1.5，2号罐(或2号罐和3号罐)为1∶1.0-1.2，3号罐(或3号罐和4号罐)为1∶0.8-1.0。1号罐搅拌常开，2和3号罐(或2和3和4号罐)搅拌时间视溶解氧情况常开或间歇开搅拌。其它发酵条件参照半连续发酵，在适当的时机向罐内流加葡萄糖、植物油、酵母浸提物等养料。在最后一个罐，即3或4号罐排料，排料方式可以参照半连续发酵进行。也可以匀速地不间断地排出成熟的发酵液。
将排出的含AVM小球的发酵液筛分小球状物并甩干后直接进入提取罐。提取溶剂用甲苯或乙酸乙酯，活性碳脱色，无水硫酸钠脱水后减压浓缩(温度在50-65℃之间)，加入AVMB1a晶种进行结晶，即可获得阿维菌素晶体。
连续发酵若干天后，生产菌株普遍出现老化现象后的处理方法同半连续发酵。
AVMB1a五步法提取工艺本发明使用菌种(AVHF-66、AVHF-31)通过上述的发酵方法得到了大量含有AVMB1a的蜡质状小球的发酵原液，然后发明人将AVMB1a的原提取工艺过程简化为下述的“五步法”，从而节约了大量有机溶剂并减少提炼设备的投资。“五步法”提取工艺详细说明如下
1.通过筛分从发酵原液收集AVM蜡质小球利用AVHF-31等菌种发酵得到的发酵原液中悬浮着大量乳白色至黄色的蜡质状小球，这些小球是从AVHF-31等生产菌种细胞中分泌出的阿维菌素凝集而成。这种小球疏水性较强，颗料直径在0.5mm以上，很容易用筛分的办法将其与菌丝体和水分开。筛分选用振动筛或旋转筛均可。筛网用40-80目不锈钢网。筛分时将自来水管和输送发酵液的管道都引到筛网上，即一边放发酵液，一边用自来水缓慢地冲洗筛网。筛网上方可以收集到AVM蜡质小球，筛网下方的水中含大量菌丝体。菌丝体悬液进入碟片式离心机或板框，回收的菌丝体可以生产杀土壤线虫的农药或做成抗生菌肥。
2.离心甩干AVM蜡质小球用三足式离心机甩干湿的AVM小球，三足式离心机内衬有100目(或80目)的不锈钢网，此网可以方便的拆卸下来，以便收集AVM小球和清洗网眼。
3.乙酸乙酯溶解AVM蜡质小球甩干的AVM小球用乙酸乙酯溶解，视溶解液的颜色，确定是否需要加脱色剂脱色。将溶解液用无水硫酸钠进行脱水，得到脱水液。
4.浓缩脱水液脱水液用真空浓缩锅进行浓缩，浓缩温度50℃-60℃，浓缩真空度为-0.09Mpa，浓缩至AVMB1a浓度达到5％以上。
5.结晶在结晶罐中进行结晶，晶种为晶形好的AVMB1a晶体，用量为0.05％-0.1％(w/v)。结晶液为石油醚加无水乙醇，二者体积比为85∶15。
农药用阿维菌素原料免提炼工艺目前制备农药用所需阿维菌素的量越来越大，已成为AVM原药最大的市场。应用本发明的菌种发酵生产AVM，可以按常规方法生产阿维农药的原料(即将结晶母液浓缩为油膏，以油膏作为AVM农药的生产原料)，也可以按本发明特殊的生产工艺——“免提炼工艺”直接生产。该法的生产过程是将发酵原液以湿筛法筛出其中的AVM蜡质小球，经过三足式离心机甩干之后以40℃左右热风风干，经含量检测，密封遮光包装即成为生产阿维农药的原料。
图1是本发明的连续发酵工艺中发酵罐连续方式及物料流动的示意图。
其中1、接蒸汽总管2、接空气总过滤器3、培养基配制罐4、蒸汽过滤器5、空气预过滤器6、空气精过滤器7、种子罐8、1号发酵罐9、2号发酵罐10、3号发酵罐11、连消塔12、维持罐13、板式热交换器
14、温度降至30℃左右的无菌发酵培养基15、补料罐16、从上排放口放出的含阿维菌素蜡质球状物与发酵液之混合液17、接湿筛机(筛网40-80目)图2是本发明的AVMB1a五步法提取工艺流程示意图。
具体实施方式在以下实施例中将进一步举例说明本发明，这些实施例仅用于说明本发明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1使用除虫链霉菌AVHF-31菌株按分批发酵法生产阿维菌素。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种AVHF-31菌株。于28℃恒温箱中培养5天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
准备10L种子罐，投料系数65％。种子培养基成份为淀粉3％，豆饼粉0.8％，花生饼粉0.9％，酵母膏0.45％，酵母粉0.45％，玉米浆0.3％，氯化钴0.003％，消泡剂0.06％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7.2。121℃蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃后接种AVHF-31菌株的孢子悬浮液。接种量为每罐种子培养液(6.5L)接种2支试管斜面种子。在通气量1∶0.8，27℃，350转/分搅拌条件下培养36小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝，无杂菌污染情况下移种至100L发酵罐中。
发酵罐中发酵培养基为淀粉10％，活性干酵母粉1.0％，玉米粉1％，豆饼粉1.5％，氯化钾0.6％，磷酸二氢钾0.03％，氯化钴5μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.03％，碳酸钙0.3％，耐高温淀粉酶0.01％，，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0.01％，用自来水定容至70L，投料系数70％，消前pH7.0。经灭菌后接种，接种量为9.3％，在罐温28℃，通气量1∶0.8，搅拌速度230转/分下培养，当发酵液中还原糖含量低于1.0％时，通过补料罐流加补糖。一共培养12天左右。当pH上升至7.5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开放罐阀门，放出全部发酵液，用湿筛法收获AVM的蜡质球状物(1400克)。用4000ml乙酸乙酯溶解球状物，活性碳脱色，无水硫酸钠脱水，然后真空浓缩，最后加入AVMB1a晶种得到阿维菌素结晶282.3克，其中B1a组分253克。
实施例2使用除虫链霉菌AVHF-66菌株按分批发酵法生产阿维菌素。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种AVHF-66菌株。于27℃恒温箱中培养7天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
准备10L种子罐，投料系数65％。种子培养基成份为淀粉4％，豆饼粉0.5％，花生饼粉1.2％，活性干酵母粉0.3％，玉米浆0.5％，氯化钴0.0015％，消泡剂0.04％，消毒前用氢氧化钠溶液调节pH至7.2。121℃蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃后接种AVHF-66菌株的孢子悬浮液。接种量为每罐种子培养基(6.5L)接种3支试管斜面孢子。在通气量1∶1.0，27℃，350转/分搅拌条件下培养24小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮，多分枝，无杂菌污染情况下移种至100L发酵罐中。
发酵罐中发酵培养基为淀粉11％，活性干酵母粉1.4％，玉米粉1％，豆饼粉1.0％，花生豆饼粉0.5％，氯化钾0.2％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钴5μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.2％，耐高温淀粉酶0.0004％，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0.06％，用自来水定容至70L，消前pH7.2。经灭菌后接种，接种量为9.0％，在罐温28℃，通气量1∶1.8，搅拌速度250转/分下培养12天，当pH上升至7.5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a达到最高峰值时，打开罐底放罐阀门，边放料边湿筛，筛网孔径为80目，收集呈蜡质的AVM球状物1328.6克(干重)。在干球状物中阿维菌素的含量为21％。用4000ml乙酸乙酯溶解，活性碳脱色，无水硫酸钠脱水，浓缩至1200毫升左右，最后加入晶种得到阿维菌素结晶279.1克，其中B1a组分251.2克。补料方法及主要工艺参数见实施例1。
实施例3、4、5采用与实施例1完全相同的步骤，只是将AVHF-31菌株分别替换为AVHF-27、AVHF-49和AVHF-61菌株按分批发酵法生产阿维菌素。
这三个菌种的产量如表1所示表1 AVHF-27、AVHF-49和AVHF-61三个菌株分批发酵AVMB1a产量
比较实施例使用除虫链霉菌LAF-108菌株(即专利文献CN1294197A中的菌种CCTCC NOM200028)按分批发酵法生产阿维菌素。
按照前面所述的麦芽粉淀粉无机盐琼脂斜面培养基配方制备斜面。经过3天预培养，若未发现杂菌生长则接种LAF-108菌株。于28℃恒温箱中培养6天，待孢子成熟后收取，贮存于4℃冰箱中供发酵用。
种子制备过程同实施例1。
发酵罐中发酵培养基为淀粉9％，活性干酵母粉1.2％，玉米粉1％，氯化钾0.4％，磷酸二氢钾0.04％，氯化钴5μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.04％，碳酸钙0.2％，耐高温淀粉酶0.005％，并预先加入含泡敌和植物油的混合消泡剂0.02％，用自来水定容至70L，投料系数70％，消前pH7.0。经灭菌后接种，接种量为8.5％，在罐温28℃，通气量1∶0.9，搅拌速度250转/分下培养，当发酵3天后，发酵液中还原糖含量低1％时，通过补料罐流加葡萄糖使之回升至1.3％以上。当pH上升至7.5以上，菌丝明显自溶，阿维菌素之B1a组分达到最高峰值时，打开放罐阀门，放出发酵液，通过湿筛机收获AVM的蜡质球状物。在干球状物中阿维菌素的含量为20％。用3300ml醋酸乙酯溶解球状物，活性碳脱色，脱色液再经无水硫酸钠脱水，减压浓缩去一半体积，趁热加入AVMB1a晶种并缓慢降温得到阿维菌素结晶65.0克，其中B1a组分58.5克。
实施例6使用除虫链霉菌AVHF-31菌株按半连续发酵法生产阿维菌素。
在100L发酵罐圆柱体侧面罐高约70％的地方开一排放孔，并安装相应的管道阀门。
如实施例1所述制备斜面菌种准备和种子液。配制半连续发酵的发酵培养基淀粉8％，活性干酵母粉1.2％或鲜酵母泥12升，玉米粉1.0％，豆饼粉1.2％，氯化钾0.4％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钴5μg/ml(终浓度)，硫酸镁0.04％，碳酸钙0.3％，耐高温淀粉酶0.005％，按培养基体积的0.06％加入含泡敌和植物油的混合消泡剂，用自来水定容至70L，消前pH7.2。在140℃蒸汽连消灭菌后进入发酵罐，冷却至28℃接种，接种量为10％，在罐温28℃，通气量1∶1.1，搅拌速度250转/分下发酵培养，发酵进行至48小时后，每隔8小时检测一次发酵液中的总糖、还原糖、氨基态氮和阿维菌素B1a组分含量。当还原糖低于1.0％时开始补料。所补充的营养液配方为葡萄糖10％，植物油(豆油)1％。从第9天开始每8小时取样镜检菌丝衰老与否。若有衰老现象则在流加营养液中增加适量的酵母浸提物，磷酸二氢钾和玉米浆。从第9天开始，每次取样检查发酵液中上清液部分阿维菌素B1a组分含量。在HPLC法测得阿维菌素B1a组分含量高于2500μg/ml时，短时间停止搅拌和通气，同时打开上述排放孔阀门，排出浮在发酵液上层的AVM蜡质球状物，该球状物与水共约10升。湿筛得到蜡质球状物174克，其中阿维菌素的含量为18.5％。然后，添加新鲜培养液10升，24小时重复上述发酵过程一次，共进行12次，12次共获得含素蜡状物3450.8克。21天后菌丝出现明显衰老自溶，此时放罐。每次获得的球状物直接进入提取罐，用3倍体积的醋酸乙酯进行溶解，然后过滤，脱色脱水，浓缩，最后加入阿维菌素B1a结晶，得到阿维菌素结晶，总共得到阿维菌素441.1克，其中得到阿维菌素B1a组分397.0克。
按本实施例的工艺，100L发酵罐在20天内获得461.1克阿维菌素，较实施例1的11天获得182.3克提高了工作效率。有机溶剂的消耗比率与实施例1相仿。
实施例7、8、9、10使用除虫链霉素AVHF-66等四个菌株按半连续发酵法生产阿维菌素。
采用与实施例6完全相同的步骤，只是将AVHF-31菌株分别替换为AVHF-66、AVHF-27、AVHF-49和AVHF-61菌株，最后得到的阿维菌素的结晶产量见表2表2 AVHF-66等4个菌株半连续发酵22天AVMB1a总产量
实施例11使用除虫链霉菌AVHF-31菌株按连续发酵法生产阿维菌素。
发酵罐改造同实施例6，在2号和3号发酵罐同一侧的圆柱体部位，高约罐体总高度70％处开一排放孔，并在2号和3号发酵罐上设补料品，在上排放口和补料品安装相应的管道阀门。3个罐之间的连接方式如附图1所示液体种子的培养基配方同实施例1，发酵培养基同半连续发酵培养基(见实施例6)。发酵培养基通过连续灭菌系统灭菌，将温度降至28℃左右后贮存于发酵培养基贮罐内。
本连续发酵工艺采取的稀释度为0.01(1/h)，串联罐数为3个，每个罐的工作容量为100L，容积比1∶1∶1。温度1号罐和3号罐为28℃，3号罐为26℃；pH1号罐为6.8，2号罐为6.5，3号罐为6.8；风量1号罐为1∶1.2，2号罐为1∶1.0，3号罐为1∶0.8。1号罐搅拌常开，2和3号罐搅拌时间视溶解氧情况常开或间歇开。搅拌速度为250转/分。参照实施例6提供的参数，在需要补料时向罐内流加葡萄糖、植物油、酵母浸提物，也可以匀速地不间断地排出成熟的发酵液。在球状物中阿维菌素的含量为19％。如此连续发酵22天后，生产菌的细胞普遍出现老化现象，停止发酵并放罐。
用湿筛法收集AVM蜡质小球状物，参照实施例1生产AVMB1a结晶，总共得到阿维菌素晶体1162.3克，平均每个罐每天产阿维菌素17.6克。
按本实施例的工艺，连续发酵每天每罐产出AVMB1a结晶17.6克，而实施例1中(分批发酵)同样的菌种平均每天每罐只产AVMB1a结晶16.0克，连续发酵效率提高10％。有机溶剂的消耗比率与实施例1相仿。
实施例12、13、14、15使用除虫链霉素和AVHF-66、AVHF-27、AVHF-49和AVHF-61菌株按连续发酵法生产阿维菌素。
采用与实施例11完全相同的步骤，只是将AVHF-31菌株分别替换为AVHF-66、AVHF-27、AVHF-49和AVHF-61菌株，最后得到的阿维菌素的结晶产量见表3表3 AVHF-66等4个菌种在连续发酵过程中AVMB1a每罐每天产量
实施例16利用5步法提取阿维菌素10 M3发酵罐发酵结束后得到发酵原液8.0 M3，发酵效价(AVMB1a)4200μg/ml，AVMB1a分泌率90％。理论计算可知，生产菌种分泌到细胞外的AVMB1a共为30.24公斤。这些AVMB1a与AVM的其它组份一起形成一些蜡质的小颗粒悬浮在发酵液中。提取这些AVMB1a并形成结晶分为如下5步第一步 湿筛分离将发酵原液在发酵液贮罐内降温到25℃以下，罐压升至0.15MPa。打开放料阀将发酵原液通过管道引到湿筛机上。湿筛机的筛网为60目的不锈钢丝网。与此同时打开湿筛机上的自来水管阀门，调节发酵液的流速和自来水的流速到适当。当筛网中AVM颗粒将要装满时更换筛网，收集筛出的AVM蜡质湿颗粒。从这一罐发酵液中共筛得湿颗粒199.6kg。
第二步 蜡质颗粒甩干湿颗粒199.6kg加水600kg，在混合罐中以50转/分的搅拌转速再悬浮。利用空气压力将再悬浮的湿颗粒用管道输送到三足式离心机。此三足式离心机内衬有一特制的尼龙纱网兜，纱网网眼为120目。离心转速2000rpm。边放料边离心，当网兜中颗粒快满时停止进料。停止进料后继续离心5分钟。停机，取出甩干的AVM蜡质小球。收获甩干的AVM小球状物89.2kg。
第三步 颗粒溶解在溶解罐中用乙醋乙酯溶解已甩干的AVM蜡质颗粒。乙酸乙醋用量为20∶1(v/w)，即1公斤上述AVM颗粒加20升乙酸乙酯进行溶解，基本溶解完后按总重量的6％加入无水硫酸钠粉末，边加边搅拌(120rpm)。如果溶液颜色较深可按8％(w/w)加入粉末状活性碳脱色(发酵正常的罐不用活性碳脱色)。继续搅拌并给溶液加温，至溶液温度达到50℃时停止加温。趁热将此溶液用小型不锈钢板框过滤，去除未溶解的固体物质。本批次得到滤液1.7吨，滤液中AVMB1a含量为1.74％。
第四步 滤液浓缩在真空浓缩器中将滤液于55℃、真空度约-0.09MPa条件下浓缩15倍。
第五步 结晶配结晶液。结晶液组成为沸程为90-120℃的石油醚与无水乙醇混合而成，二者比例为石油醚∶乙醇＝85∶15(v/v)。在结晶罐中混合之后升温至55℃。将第四步所提之浓缩液缓慢加入结晶罐，边加边搅拌，搅拌转速50rpm。加完浓缩液之后可加入适量AVMB1a晶种，晶种用量1％(w/w)。以温水控制结晶罐的罐温，平均每小时令料温下1℃，在2℃-4℃时维持12小时。结晶完成后经三足式离心机收集晶体，脱溶干燥，检测AVMB1a含量。本批次共获得结晶21.89kg，其中B1a含量为92％。
权利要求
1.一种利用阿维菌素高产高分泌率菌进行发酵并采用五步提取法提取生产AVMB1a的方法，其特征在于所述的五步提取法包括步骤a.通过筛分从发酵原液收集AVM蜡质小球；b.离心甩干AVM蜡质小球；c.溶解AVM蜡质小球；d.浓缩脱水；e.加入AVMB1a晶种进行结晶。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的阿维菌素高产高分泌率菌是除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的阿维菌素高产高分泌率菌为除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)CCTCC NOM204069或虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)CCTCC NOM204070。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述的阿维菌素高产高分泌率菌为除虫链霉菌突变株，如CCTCC NOM204070。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述的发酵为分批发酵或半连续发酵。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述的发酵为连续发酵。
7.根据权利要求1的方法，在步骤c中使用乙酸乙酯溶解AVM蜡质小球。
8.根据权利要求1或7的方法，在步骤e中使用的结晶液为沸程90℃～120℃且体积比为85∶15的石油醚和无水乙醇。
9.能够将所产生阿维菌素的60％-95％分泌到细胞外的除虫链霉菌。
10.根据权利要求9的除虫链霉菌，其为除虫链霉菌CCTCC NOM204069。
11.根据权利要求9的除虫链霉菌，其为除虫链霉菌CCTCC NOM204070。
12.一种生产农药用AVMB1a原药的方法，包括步骤a.利用AVMB1a高产高分泌率菌进行发酵，获得AVM蜡质小球；b.离心甩干AVM蜡质小球；c.40℃左右热风风干蜡质小球；d.密封遮光包装。
13.在权利要求1步骤a中筛分出AVM蜡制小球后的菌丝体在生产杀土壤线虫的颗粒剂和粉剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用高产高分泌率型阿维菌素(AVM)产生菌生产阿维菌素的新方法。本方法所用菌株系对除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)CCTCC NOM200028进一步诱变，选育出的高效价高分泌率生产菌株CCTCC NOM204069、菌株CCTCC NOM204070，新菌株的发酵效价可以达到5200μg/ml(AVMB1a)，比出发菌株的效价高出约3倍。所合成AVM的60％－95％分泌到菌细胞外，并形成大量AVM的蜡质球形悬浮物。在本发明的方法中，采用“五步法”提取发酵原液中的阿维菌素，大大降低了生产成本。另外，当发酵产生的AVM用于农药原药生产时可采用免提炼工艺来进行。
文档编号A01N63/00GK1757744SQ200410009639
公开日2006年4月12日 申请日期2004年10月9日 优先权日2004年10月9日
发明者林开春, 朱时炎, 骆雪梅, 喻方春, 张用梅 申请人:武汉绿世纪生物工程有限责任公司, 武汉天惠生物工程有限公司