专利名称：一株荧光假单胞菌及其发酵培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株荧光假单胞菌及其发酵培养方法与应用。
背景技术：
植物根际中存在着一些有益细菌，它们可以通过直接或间接的方式促进植物生长并对由病原菌引起的植物病害起到防治作用，这些能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物统称为促生根际菌(plant growth promoting rhizobacteria，简称PGPR)。PGPR对土壤中的有害病原微生物以及非寄生性根际有害微生物(deleterious rhizosphere microorganisms，简称DRMO)具有生物防治作用。此外，对植物吸收利用矿物质营养也具有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
研究表明，植物幼苗生长时根部会合成一定量的乙烯，它对植物生长，尤其是根的生长具有抑制作用。1-氨基环丙烷-1-羧酸盐(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，简称ACC)脱氨基酶可以分解乙烯合成的直接前体物质ACC，从而抑止植物体中乙烯的合成，降低乙烯水平。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有促进植物生长及防治病害作用的荧光假单胞菌及其发酵培养方法。
本发明所提供的荧光假单胞菌菌株是(Pseudomonas fluorescens)MX01，该菌株已于2005年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1469。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469属革兰氏阴性杆菌，细胞单个，具鞭毛，能运动。该菌专性好氧，在LB固体培养基上28℃培养2-3天，可长出单菌落，菌落呈白色，圆形，边缘整齐、光滑。其生理生化特性为可在4-37℃下生长，产荧光色素，氧化酶反应、精氨酸双水解反应、接触酶反应和明胶液化反应均呈阳性，水解淀粉反应呈阴性；可以利用多种碳源进行生长，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、D-木糖、D-果糖、麦芽糖、甘露醇、肌醇、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸或β-丙氨酸等。
本发明的第二个目的是提供一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469的发酵培养方法。
本发明所提供的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469的发酵培养方法，包括以下步骤1)将经活化的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469接种到该菌专用发酵培养基中，在27-30℃、pH6.5-8.0下培养36-48小时，得到种子液；2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，在26-32℃、pH6.5-8.0下通气培养；所述步骤1)和步骤2)中荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469专用发酵培养基配方为每1000mL水中含玉米粉25-35g，豆饼粉25-35g，麸皮粉16-24g，K2HPO416-24g，KH2PO46-10g，MgSO40.5-1.0g，起始pH7.2-8.0。
在上述发酵培养方法中，对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCCNo.1469菌株进行活化的方法为将该菌株接种到金氏B培养基中，在27-30℃下培养24-48小时；所述金氏B培养基的配方为每1000mL水中含蛋白胨20g，甘油10mL，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO4，1.5g，琼脂18g，pH7.0-7.4。
优选的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469专用发酵培养基配方为每1000mL水中含玉米粉30g，豆饼粉30g，麸皮粉20g，K2HPO420g，KH2PO48g，MgSO40.75g，pH7.2-8.0。
为得到更好的发酵效果，上述荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469专用发酵培养基中还添加有一定浓度的消泡剂，消泡剂的添加剂量可根据具体所用的消泡剂种类而定，所述消泡剂可为任意一种市售消泡剂，优选的消泡剂为泡敌，其添加浓度优选为0.05％；所述百分比浓度为质量百分比浓度。
步骤1)中的接种比例为1-2％，培养条件优选为在28℃、pH7.0、200rpm下振荡培养。
步骤2)中的接种比例为2-4％，发酵液体积与每分钟通气量体积比为1∶0.5-0.8，罐压为1.5-2.0F/cm2，搅拌速度为150-250rpm，优选为200rpm，培养24-48小时即可到达培养终点；其中，在28℃、pH7.0及上述条件下通气培养36-48小时为优选的发酵培养条件。
本发明的另一个目的是提供一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469菌剂。
本发明所提供的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂，其活性成分为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469。
为得到更好的使用效果，所述菌剂中还含有填充料，如凹凸棒土或草炭等，填充料的细度为150-250目，优选为200目。
一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂的生产方法，是将经上述方法发酵的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCCNo.1469的菌液与干燥、无菌的填充料按重量份数比8-10∶1混合后，压滤，压滤后遮荫风干，最终得到活菌量不小于20亿个/克的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂；所述填充料可为凹凸棒土或草炭，细度为150-250目，优选为200目。
在实际生产中，根据菌剂含水量的要求，将荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469的菌液与填充料混合、压滤后，可再添加一定量的助剂，如草炭、凹凸棒土或硅藻土，优选为草炭，细度为150-250目，优选为200目，助剂的添加剂量可根据菌量和含水量的实际情况而定，在不影响产品效果的前提下，使荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂的含水量达到30-40％即可。
应用本发明的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469或以其为活性成分的菌剂促进植物生长的方法可为播种前，将植物种子用浓度为107-109cfu/mL的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液浸种0.5-2小时，或用以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCCNo.1469为活性成分的菌剂拌种，菌剂与种子的重量份数比为1∶0.5-2，再经播种、培养，获得生长得到促进的植物。
在上述促进植物生长的方法中，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469菌液浓度优选为108cfu/mL，浸种时间优选为1小时；以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂与种子混合的重量分数比为1∶1。
应用本发明的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469或以其为活性成分的菌剂防治植物病害的方法可为待植物生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为107-109cfu/mL的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469菌液浸根20-40分钟，或将取出的幼苗以荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水的重量份数比为1∶400-600，再经移栽、培养，得到抗病害的植物。
在上述植物的病害防治方法中，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469菌液浓度优选为108cfu/mL，浸根时间优选为30分钟；以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂与水混合的重量份数比为1∶500。
本发明提供了一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469及以其为活性成分的菌剂，温室盆栽和田间试验证明该菌株具有促生和防病双重作用，不仅可有效促进植物生长，而且对多种植物土传病害，如番茄青枯病、小麦全蚀病、蔬菜作物的丝核菌立枯病具有显著的防治效果。分子遗传学研究表明该菌株促进植物生长的主要机制是其具有1-氨基环丙烷-1-羧酸盐(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，简称ACC)脱氨基酶基因，ACC脱氨基酶可降低植物苗期根部及其周围乙烯的含量，从而刺激植物生长。防治植物病害的主要机制是其良好的植物根围定殖能力和产生抑制病原菌生长的抗生素类物质。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469发酵周期短，其菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。本发明在促进作物生长及植物土传病害的防治中具有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
金氏B培养基的配方为每1000mL水中含蛋白胨20g，甘油10mL，MgSO4·7H2O1.5g，K2HPO4，1.5g，琼脂18g，pH7.0-7.4。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469专用发酵培养基配方为每1000mL水中含玉米粉30g，豆饼粉30g，麸皮粉20g，K2HPO420g，KH2PO48g，MgSO40.75g，0.05％泡敌，pH7.2-8.0。
实施例1、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469的保藏及其发酵培养1、菌种的保藏荧光假单胞菌菌株(Pseudomonas fluorescens)MX01分离自山东省小麦根围土壤，已于2005年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1469。
2、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469的发酵荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469的发酵培养方法，包括以下步骤1)菌种的活化将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌株接种到金氏B液体培养基中，在28℃下培养36小时。
2)种子罐培养将步骤1)经活化的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469按2％接种比例接种到该菌专用发酵培养基中，在28℃、pH7.0、200rpm下振荡培养40小时，得到种子液。
3)发酵罐培养将步骤1)制备的种子液按3％接种比例接种到该菌专用发酵培养基中，在28℃、pH7.0、搅拌速度200rpm、通风量10.5-0.8(发酵液体积每分钟通气量体积)、罐压1.5-2.0F/cm2下通气培养40小时，得到荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液。
实施例2、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂的制备荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂的制备方法为将实施例1发酵制得的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCCNo.1469的菌液与干燥、无菌、细度为200目的草炭按重量份数比10∶1混合后，压滤，再加入适量的200目的草炭使菌液与草炭充分混匀，遮荫风干，得到荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂。经检测成品合格，含水量为35％，活菌含量大于20亿个/克。
实施例3、检测荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469对植物促生效果的试验以油菜为例，检测荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469对植物的促生效果，具体方法为将油菜种子表面消毒后，在28℃下放置12-24小时催芽；然后将油菜种子用实施例1发酵获得的浓度为108cfu/mL的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液浸种1小时，或用以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂拌种，菌剂与种子的重量分数比为1∶1，以未经处理的油菜种子为对照，再经播种、培养，15天后观察植株生长情况，称量根部鲜重，测量地上部株高。结果经荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液或以其为活性成分的菌剂处理的植株的根部鲜重较对照植株平均增加32.8％，地上部分株高也增加29.1％，具有较好的促生效果。用同样方法进行田间试验，结果促生效果也可达到10-20％。
实施例4、检测荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469对植物病害防治效果的试验以番茄青枯病为例，检测荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCCNo.1469对植物病害的防治效果，具体方法为待用灭菌土培育的番茄苗生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为108cfu/mL的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液浸根30分钟，或将取出的幼苗以荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水的重量份数比为1∶500，以未经处理和用灭菌水灌根的植株作对照，再将幼苗移栽至8cm口径的苗钵中，缓苗3天后灌根接种浓度为107cfu/mL的番茄青枯病菌培养液50mL/钵，接种病原菌后定期按病害分级方法调查病情指数，结果经荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌液或以其为活性成分的菌剂处理的植株的防治效果达86.3％。用相同方法进行的小麦全蚀病、蔬菜作物的丝核菌立枯病的盆栽和田间抗病性试验结果表明本发明的菌株对上述病害的防治效果也高于60％。上述试验结果均表明本发明的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469可显著提高植物的抗病性。
权利要求
1.荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469。
2.荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469的发酵培养方法，包括以下步骤1)将经活化的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469接种到该菌专用发酵培养基中，在27-29℃、pH6.5-8.0下培养36-48小时，得到种子液；2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，在26-32℃、pH6.5-8.0下通气培养；所述步骤1)和步骤2)中荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469专用发酵培养基配方为每1000mL水中含玉米粉25-35g，豆饼粉25-35g，麸皮粉16-24g，K2HPO416-24g，KH2PO46-10g，MgSO40.5-1.0g，起始pH7.2-8.0。
3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于所述步骤1)中对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌株进行活化的方法为将该菌株接种到金氏B培养基中，在27-30℃下培养24-48小时；所述金氏B培养基的配方为每1000mL水中含蛋白胨20g，甘油10mL，MgSO4.7H2O 1.5g，K2HPO4，1.5g，琼脂18g，pH7.0-7.4。
4.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于所述荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01CGMCC No.1469专用发酵培养基配方为每1000mL水中含玉米粉30g，豆饼粉30g，麸皮粉20g，K2HPO420g，KH2PO48g，MgSO40.75g，pH7.2-8.0。
5.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于所述荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469专用发酵培养基中还添加有质量百分比浓度为0.05％的泡敌。
6.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于所述步骤1)中的接种比例为1-2％，培养条件为在28℃、pH7.0、200rpm下振荡培养；步骤2)中的接种比例为2-4％，发酵液与每分钟通气量体积比为1∶0.5-0.8，罐压为1.5-2.0F/cm2，搅拌速度为150-250rpm，培养时间为24-48小时。
7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于所述步骤2)的发酵培养是在28℃、pH7.0下进行的，培养时间为36-48小时。
8.以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469为活性成分的菌剂。
9.一种权利要求8所述菌剂的生产方法，是将荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469的菌液与干燥、无菌的填充料按重量份数比8-10∶1混合后，压滤，压滤后，遮荫风干，得到荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469菌剂；所述填充料为凹凸棒土或草炭，细度为150-250目。
10.根据权利要求9所述菌剂的生产方法，其特征在于所述得到的菌剂用细度为150-250目的草炭、凹凸棒土或硅藻土调整至最终的含水量为30-40％。
全文摘要
本发明公开了一株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)MX01 CGMCC No.1469及其发酵培养方法与应用。温室盆栽和田间试验证明该菌株不仅可有效促进植物生长，而且对多种植物土传病害，如番茄青枯病、小麦全蚀病、蔬菜作物的丝核菌立枯病具有显著的防治效果。分子遗传学研究表明该菌株促进植物生长的主要机制是其具有1－氨基环丙烷－1－羧酸盐(1－aminocyclopropane－1－carboxylate，简称ACC)脱氨基酶基因，ACC脱氨基酶可降低植物苗期根部及其周围乙烯的含量，从而刺激植物生长；防治植物病害的主要机制是其良好的植物根围定殖能力和可产生抑制病原菌生长的抗生素类物质。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MX01 CGMCC No.1469发酵周期短，其菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。本发明在促进作物生长及植物土传病害的防治中具有广阔的应用前景。
文档编号A01N63/00GK1772881SQ20051011254
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日
发明者张力群, 席先梅, 潘林芳, 张清霞 申请人:中国农业大学