专利名称：：海洋芽孢杆菌可湿性粉剂、及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物农药可湿性粉剂及其制备和应用。更具体地说，本发明涉及一种海洋芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，以及该海洋芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物病害方面的应用。背景近年来，随着环境的恶化、作物连作以及单一种植，植物病害的发生越来越严重，这已经严重影响了整个农业的发展。并且为了经济利益，农民通常采用縮短用药间隔时间，加大用药量和用药种类的方法来控制植物病害，同时又用超常规的激素用量来降低化学农药对植物本身的伤害。超量的农药和激素对蔬菜和瓜果造成严重的污染，其急性毒性和潜在的致癌作用对人体的健康构成很大的威胁。因此，农业部决定在全国范围内实施"无公害食品行动计划"，而使用无公害农药是实施这一目标的关键措施。在无公害农药的开发过程中，微生物活菌制剂的开发受到越来越多的重视，其制剂中的有效成分一一活菌不仅可以直接对病原菌产生拮抗或抑制作用，而且在植物体内定植的活菌可以持续不断地分泌活性物质，从而达到杀菌或抑菌的目的，从而使产品的防病持续期延长。并且来自自然界的活菌对环境友好，满足绿色环保的要求。而到目前为止，虽然以海洋中的活性物质为有效成分的产品较多，但大部分是以提取海产品中的壳聚糖作为肥料，而将海洋中的微生物开发成农药却未见报道。更无关于海洋芽孢杆菌开发成农药的报道。
发明内容本发明的目的是为了提供一种可防治植物病害的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。本发明对来源于海洋的细菌B-9987进行了分离和鉴定，然后将该海洋芽孢杆菌B-9987进行培养，获得高活菌含量、高芽孢率的发酵液，再将其与载体和助剂混合，经过干燥、粉碎得到一种可湿性粉剂，该可湿性粉剂可有效防治植物病害，从而完成了本发明。本发明第一方面提供了海洋芽孢杆菌B-9987的分离和鉴定。本发明的第二方面提供了海洋芽孢杆菌B-9987培养工艺的优化，以期获得较为合适的可以进行可湿性粉剂生产的海洋芽孢杆菌B-9987发酵液。本发明第三方面提供了一种制备上述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的方法，该方法包括将海洋芽孢杆菌发酵液、载体、助剂混合，得到的混合物，干燥后粉碎，得到所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂中的B-9987活菌含量为lxl06cfu/glxl012CfWg;所述载体选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土和高岭土中的一种或多种；所述助剂选自十二烷基苯磺酸钠、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的一种或多种。所述的可湿性粉剂的干燥方法包括通过静态(如减压蒸发等)或动态(如喷雾干燥、气流干燥等)的方式来干燥，后续的粉碎包括机械或气流粉碎。本发明第四方面涉及本发明的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物病害中的应用。本发明首次将海洋芽孢杆菌B-9987开发成微生物农药可湿性粉剂，其对病害的防治范围广、防效高。该可湿性粉剂不仅可以单独使用，而且也可以和其它微生物农药和助剂复配来使用。具体实施方式本发明提供了一种海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，它由海洋芽孢杆菌B-9987、载体和助剂组成，所述海洋芽孢杆菌B-9987在可湿性粉剂中的活菌含量为lxl06cfu/glxl012cfb/g。在一个较佳的实施方案中，所述载体选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土和高岭土中的一种或多种；所述助剂选自十二垸基苯磺酸钠、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的一种或多种。本发明中所用的海洋芽孢杆菌为海洋芽孢杆菌B-9987，其保藏号为CGMCCNo.2095。上述助剂在可湿性粉剂中的重量百分比通常为0.01%10%，较佳为0.1%5%，更佳为1%3%。本发明上述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂可用以下方法获得，该方法包括将含有海洋芽孢杆菌活菌的发酵液、载体和助剂混合，得到的混合物，通过合适的方式干燥后粉碎(包括静态(如减压蒸发等)和动态(如喷雾干燥、气流干燥等)干燥，粉碎包括机械或气流粉碎)，即可得到所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。本发明所用的术语"发酵液"、"活菌"、"载体"、"助剂"、"可湿性粉剂"等具有本领域技术人员通常熟知且承认的含义。在一个较佳的实施方案中，所述海洋芽孢杆菌活菌来自海洋芽孢杆菌发酵液，所述发酵液含有芽孢状态的海洋芽孢杆菌活菌、非芽孢状态的海洋芽孢杆菌活菌、和/或所述海洋芽孢杆菌的代谢产物。所述发酵液可通过在适合生长的条件下培养海洋芽孢杆菌(具体例如上述的海洋芽孢杆菌B-9987)，使其生长至一定的浓度来获得。用于培养本发明中菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其它营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉等。氮源可以是蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等。培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在培养时可采用豆油、泡敌等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在5.58.0之间，培养温度宜在2035"之间。培养时间通常在12h200h之间，最终的菌浓度通常可高达5xl0、fo/mllxl0"cfo/ml。在本发明的一个较佳的实施方案中，宜使所述发酵液中含有较高含量的芽孢，以赋予微生物耐高温的特性，以便在后续的干燥和粉碎过程中获得更高的活菌含为了获得含芽孢的海洋芽孢杆菌发酵液，通过调节培养过程中的气液比、转速来改变培养环境的溶氧水平(DO)，通过延长培养时间，可以使培养过程中的活菌芽孢率在0100%之间变化，较佳的是使活菌芽孢率在10%以上，更佳的是在30%以上，还要佳的是在50%以上。在本发明的一个较佳的实施方案中，所述海洋芽孢杆菌B-9987通过以下方法培养获得在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中，在通气量控制在气液比为0.2:12:1、转速在100r/min或以上，培养所述海洋芽孢杆菌24小时以上，其中所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉和大米粉中的一种或几种，所述氮源选自蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和大豆粉中的一种或几种，所述无机盐包括常规的无机盐(如MgS04、(NH4)2S04、MgCl2、KCl、KH2P04、NaCl、K2HPO^PCaC03)。在一个较佳的实施方案中，所述培养基具有以下组成葡萄糖0.01~1.5%、蔗糖0.01~1.0%、酵母粉0.05~1.0%、蛋白粉0.02~1.2%、MgCl20.001~0.15%、KCl0.001~0.5%、KH2P040.001~0.15%禾卩NaCl0.01~2%。上述列举的这些参数只是实现本发明的较佳方案。因此，本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得本发明的发酵液。所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂中的载体和助剂对本发明的海洋芽孢杆菌活菌体、发酵液以及可湿性粉剂防治植物病害的生物效果无影响。所述载体可选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土和高岭土中的一种或多种。助剂包括十二垸基苯磺酸钠、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的一种或多种。上述助剂在可湿性粉剂中的重量百分比皆为0.01%10%。上述这些载体和助剂均可市售购得。载体细度要求通过44pm筛的比例大于95%，更佳为大于98%。为了便于长期贮存，将发酵液与载体、助剂按照一定的比例混合后得到的混合物，干燥后粉碎来试制可湿性粉剂。其干燥和粉碎步骤采用本领域中的常规技术。为了能使海洋芽孢杆菌可湿性粉剂中的有效成分尽可能保持较高的含量和较长的贮存期，含有海洋芽孢杆菌的可湿性粉剂含水量的重量百分比宜控制在小于20%，更佳为小于15%。在一个较佳的实施方案中，本发明涉及的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂其活菌含量为lxl06cfo/glxl0i2cfWg，细度(通过44pm筛)大于95%，悬浮率大于34%，润湿时间小于180s，满足国家对农药可湿性粉剂的要求。本发明中涉及的防治植物病害的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂使用方法就是农业中常用的灌根和喷雾的方法。上述用药方法，如将可湿性粉剂稀释一定倍数后对植物进行灌根的方法和稀释后利用喷雾设备进行喷雾的方法是本领域中的常规技术。本发明者还发现，本发明的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂可防治植物菌核病、灰霉病、白粉病、纹枯病、赤霉病、白叶枯病、稻瘟病、立枯病、白锈病、霜霉病、斑枯病、叶霉病、早疫病、黑斑病。本发明的内容、优点和目的可从下文进一步详细描述中清楚地得知。实施例1海洋芽孢杆菌B-9987的筛选和鉴定本实施例描述了海洋芽孢杆菌B-9987的分离筛选和鉴定。从海洋环境中分离得到402株海洋真菌，1032株海洋细菌，利用稻瘟霉96孔板筛选模型对其无细胞滤液进行生物活性筛选，经过初筛和复筛得到活性强的菌株45株，其中海洋真菌13株、海洋细菌32株。选择了3株活性最强的海洋细菌测试了其菌株产生的活性物质的遗传和热稳定性。选择能产生活性高、稳定性好的代谢物质的一株菌株，命名为B-9987。对分离得到的菌株B-9987进行了鉴定。染色按本领域常规方法进行革兰氏染色。形态特征于改良的2216E培养基、加海水的LB琼脂培养基上28'C培养2天，取菌体涂片，染色后用光学显微镜观察菌体形态。培养特征在上述培养基培养2天后观察菌落形成及颜色。生理生化特征参照《Bergey，sManualofSystematicBacteriology》方法和《常见细菌系统鉴定手册》进行。实验结果(1)革兰氏染色结果表明，B-9987菌株为革兰氏阳性。(2)菌落特征菌落白色至浅黄色，不透明，有皱褶，边缘锯齿状。(3)形态和培养特征B-9987菌株菌体直杆状或近直杆状，周生鞭毛，有芽孢，芽孢圆形，0.53.0^nxl.411.5pm，能运动；好氧生长，兼性厌氧，在上述培养基无可溶性色素。(4)生理生化特征B-9987菌株的生理生化特征见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)根据上述分析和鉴定结果，将其与细菌鉴定手册相比较，将B-9987菌株鉴定为海洋芽孢杆菌(5flc/〃wsmaWm^)。该菌株已经于2007年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.2095。实施例2海洋芽孢杆菌发酵液中芽孢培养工艺本实施例通过改变如下发酵参数来控制海洋芽孢杆菌发酵液中的活菌芽孢率通气量、转速、培养时间。结果与分析本部分发明考察了通气量和转速的改变以及培养时间的延长对海洋芽孢杆菌产芽孢的影响。发酵结果表明，当海洋芽孢杆菌在上述优化后的培养基(葡萄糖0.011.5%、蔗糖0.01~1.0%、酵母粉0.05~1.0%、蛋白粉0.02~1.2%、MgCl20.001~0.15%、KC10.0010.5%、KH2PO40.0010.15。/o和NaC10.012。/o组成)中发酵时，气液比(每小时通气量(m3)与发酵液体积(m3)的比)由0.2:1调整为2:1时，发酵不同时间后的芽孢率如下表2。表2:不同通气量对芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表2可知，通气量加大时，芽孢形成时间提前。在2:1的气液比下，48h就可观察到有芽孢形成，在144h时，其芽孢率可达100%;而0.2:1的气液比在72h才观察到有芽孢形成，在144h时，其芽孢率才为80%。由此可知，加大通气量，可以縮短芽孢形成的时间，提高芽孢率。由表2数据也可知，发酵时间的延长有利于芽孢率的提高。发酵罐搅拌速度对海洋芽孢杆菌发酵液中活菌芽孢率(以培养96h为参考)的影响见表3。由该表可见，在其它发酵条件不变的情况下，当搅拌转速逐渐升高时，发酵液中的活菌芽孢率逐渐提高。由此可见，提高搅拌速度可以提高芽孢率。表3:不同搅拌转速对芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>综合该部分的结果，海洋芽孢杆菌芽孢培养工艺为在优化后的培养基中，接种B-9987后，在2035'C之间培养，通气量控制在气液比0.2:12:1，转速控制在100r/min或以上，培养时间大于96h，即可得到合适的B-9987发酵液。实施例3海洋芽孢杆菌可湿性粉剂载体的选择本实施例从白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土及其混合物中筛选适合海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的载体，以产品中的活菌含量高低作为筛选标准。海洋芽孢杆菌B-9987按照实施例2所述的培养工艺进行培养，得到海洋芽孢杆菌发酵液。然后将上述载体逐步加入所述海洋芽孢杆菌发酵液中，混合至载体完全润湿但无明显游离水后，将混合物放在烘箱中干燥后碾磨，得到细粉。由于不同载体吸附能力不同，因此单位重量的载体吸附的发酵液重量不尽相同。测定干燥前后样品的活菌量。活菌含量的测定采用本领域技术人员通常熟知且承认的稀释涂平板法。结果与分析本发明利用同一批海洋芽孢杆菌的发酵液和不同载体混合后制备成制剂，干燥后测定其活菌含量，白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土和高岭土作为载体制备的制剂中的活菌含量都高达lX108cfU/g以上。因此从制剂的活菌含量来看，上述载体(白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土和高岭土)均适合于作为制备可湿性粉剂的载体。实施例4海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的制备下面对海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的制备进行说明，并对制备出的可湿性粉剂参照国家标准进行了各项指标的测定。制备工艺流程海洋芽孢杆菌发酵液和载体(实施例3中的载体)、助剂(十二烷基苯磺酸钠、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠中的1种或多种)混合后(助剂在可湿性粉剂中的总重量百分比为0.01%10%)，通过合适的途径进行干燥，如减压干燥、喷雾干燥、气流干燥等动态干燥方法以及室温晾干、烘房干燥等静态干燥方法，得到的固体再通过机械或气流粉碎，即可得到海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。对得到的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂按照国家要求测定各项指标，结果如表4。表4:海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的各项指标测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>润湿时间(s)98g80细度(通过44nm筛)(％)99.0^95由表4的结果可知，得到的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂各项指标都符合农药可湿性粉剂的国家标准。实施例5海洋芽孢杆菌可湿性粉剂对植物病害的防治利用实施例4中制备的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，分别在山东、上海、河北、新疆、浙江等地进行了防治植物病害的初步药效试验。海洋芽孢杆菌可湿性粉剂稀释500倍后对根部病害(如立枯病)灌根，对叶部病害(如霜霉病、白叶枯病等)喷雾。不同病害使用的对照药剂(如菌核净、多菌灵、井冈霉素等)根据其使用说明进行使用。各种病害的病指根据不同病害的分级标准来计算。防效=(空白病指一用药病指)/空白病指xl00。丄其结果如下表5。表5海洋芽孢杆菌可湿性粉剂防治植物病害汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由上述防治数据可知海洋芽孢杆菌可湿性粉剂可有效防治菌核病、灰霉病、白粉病、纹枯病、赤霉病、白叶枯病、稻瘟病、立枯病、白锈病、霜霉病、斑枯病、叶霉病、早疫病、黑斑病。尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。权利要求1.一株来源于中国渤海潮间带植物盐地碱蓬(Suaedasalsa)根内的海洋芽孢杆菌(Bacillusmarinus)B-9987，其保藏号为CGMCCNo.2095。2.—种海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，它含有保藏号为CGMCCNo.2095的海洋芽孢杆菌B-9987、载体和助剂，其特征在于，所述海洋芽孢杆菌B-9987在所述可湿性粉剂中的活菌含量为lxl06cfu/glxl012cfb/g。3.如权利要求2所述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述载体选自白碳黑、硅藻土、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土和淀粉中的一种或多种；所述助剂选自十二垸基苯磺酸钠、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠中的一种或多种。4.如权利要求2或3所述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述助剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.01%10%。5.如权利要求2所述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的含水量小于15%重量，通过44^筛的比例大于95%，悬浮率大于34%，润湿时间小于180s。6.—种制备如权利要求2所述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将含保藏号为CGMCCNo.2095的海洋芽孢杆菌B-9987活菌的发酵液与载体、助剂混合，得到的混合物通过静态或动态干燥后再通过机械或气流粉碎，得到所述海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵液含有芽孢状态的海洋芽孢杆菌B-9987活菌、非芽孢状态的海洋芽孢杆菌B-9987活菌、和/或所述海洋芽孢杆菌B-9987的代谢产物。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述海洋芽孢杆菌B-9987的发酵液是通过以下方法培养获得的在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中，在通气量控制在气液比为0.2:12:1、转速在100r/min或以上，培养所述海洋芽孢杆菌24小时至168小时，其中所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉或/和大米粉，所述氮源选自蛋白粉、酵母粉、花生饼粉或/和大豆粉。9.权利要求2所述的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物病害中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病害选自菌核病、灰霉病、白粉病、纹枯病、赤霉病、白叶枯病、稻瘟病、立枯病、白锈病、霜霉病、斑枯病、叶霉病、早疫病、黑斑病。全文摘要本发明涉及一种海洋芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用，该可湿性粉剂由载体、助剂和海洋芽孢杆菌B-9987发酵液混合后经干燥、粉碎而得到。本发明的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂通过灌根或喷雾可用来防治植物病害。文档编号A01N25/14GK101331881SQ200710042798公开日2008年12月31日申请日期2007年6月27日优先权日2007年6月27日发明者张久明,李元广,李淑兰,黎田,罗远婵,立郑,魏鸿刚申请人:国家海洋局第一海洋研究所;华东理工大学;上海泽元海洋生物技术有限公司