专利名称：：一种水稻细胞质雄性不育基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体涉及分离克隆一种水稻细胞质雄性不育基因及其在植物育种中的应用。
背景技术：
：众所周知，通过不同品种间的异花受粉，植物可能产生在生长势、适应性、产量等方面具有优势的杂种，利用这些优势可以提高农作物的产量、质量和抗性。但水稻是一种雌雄同株的自花授粉植物，要生产杂交水稻种子，必须选育一个雄性不育的品种，让雌蕊接受来自异株的花粉。1970年，袁隆平的研究小组找到一株普通野生稻(Oo^an^;ogow)的天然雄性不育株，称为"野败"。然后把野败不育株作为不育细胞质的供体，通过与栽培籼稻(0.sa"va^p./"Ac")杂交和回交，将此不育细胞质转入栽培稻，进而育出杂交稻生产上所需的不育系、保持系和恢复系。利用不育系和恢复系做亲本杂交可省去除雄的操作，便于生产高纯度的杂交种子，因此有重要的生产应用价值(袁隆平.1977.中国农业科学.1:27-31，Lin,andYuan1980.In:IRRI(eds)Innovativeapproachestoricebreeding.IRRI,Manila,p35-51)。在中国，已用野败不育细胞质培育了大量的"三系"杂交稻品种。三系"杂交稻在1976年开始推广种植，到1990年前后达到高峰的1.5-1.7千万公顷，约占中国水稻种植总面积的50~55%(Cheng等，2007，j朋.万W.，100:959-966)。至今中国的"三系"杂交水稻仍维持大致相等的种植面积，大部分仍然是野败型"三系"杂交稻。由于杂交稻的增产效果一般比常规稻高约20%以上，因此野败型杂交稻的大面积种植为中国的粮食生产作出了巨大的贡献，产生了巨大的经济和社会效益。多种农作物如水稻、小麦、玉米、油菜等关于雄性不育性及其育性恢复性的研究已有许多报道，在生产上已大规模用于杂交种生产。不育系可分为细胞质不育基因控制的细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,简称为CMS)和核不育基因控制的核不育(geniemalesterility,简称为GMS)。从近年发展的基因学来说细胞质雄性不育系的细胞质通常为携带不育基因的线粒体基因组，其不育基因的表达导致花粉不育；恢复系的核基因组中携带细胞质雄性不育恢复基因(restoreroffertility),简称为恢复基因或Z庙因，其花粉正常可育，可自交结实；保持系具有正常的可育细胞质，但其核基因组不携带有恢复功能的基因，花粉正常可育，可自交结实。生产上配套应用的"三系"中，保持系和不育系具有相同的核基因组，其差别是细胞质基因组不同。由于不同类型的植物细胞质雄性不育是由不育细胞质的线粒体基因组中的特异不育基因产生，其育性的恢复需要特异的恢复基因的作用(SchnaWeandWise,1998,TrendsPlantSci.3:175-180)。水稻细胞质雄性不育有多种类型，主要是(l)野败型(wildabortive,简称WA型)，属于孢子体不育；(2)包台(BT)型，属于配子体不育；(3)红莲(HL)型，属于配子体不育(朱英国，2000,水稻雄性不育的生物学，武汉大学出版社)。其中野败型不育系在"三系"杂交稻的应用最广泛。多个不同类型的细胞质雄性不育基因，包括水稻BT型细胞质雄性不育基因已被克隆(Hanson,andBentolila，2004,PlantCell16,S154-S169;Wangetal.,2006,PlantCell18:676-687)。水稻野败型不育的育性恢复主要由2对主效恢复基因i/3和i/^控制，被分别定位在第1和第10染色体(Zhang等，1997,Theor.Appl.Genet.94:27-33;张群宇等，2002，遗传学报，29:1001-1004)。但至今，野败型细胞质雄性不育基因尚未被分子克隆。克隆野败型细胞质不育雄性基因有利于认识雄性不育及其育性恢复的分子机理，创建新型不育系，培育新型杂交品种，进一步利用杂种优势达到增产的目的。
发明内容本发明的第一个目的是分离克隆水稻野败型不育细胞质雄性不育基因。本发明的第二个目的是提供上述不育基因所编码的蛋白质。本发明的第三个目的是提供上述不育基因在培育植物不育系中的应用。本发明的第四个目的是提供上述不育基因产生的分子标记或其紧密连锁标记及其在水稻育种中的应用。本发明釆用PCR扩增水稻野败型不育系和保持系的DNA，将所有PCR产物作为探针，对水稻野败型不育系，保持系和恢复系进行RNA-blot杂交，结果发现一个含有核糖体蛋白基因^/5的探针检出一种野败型不育系特异的mRNA，并且发现此mRNA受l个恢复基因的负调控。发明人构建了一个野败型不育系线粒体基因组DNA文库，用^/5探针筛选出2个阳性克隆。将这2个克隆测序分析，发现在^/5下游存在一个15742bp的重组区，替代了保持系线粒体基因组相应的一个16462bp的区域。该重组区由7个不同来源的DNA片段组成，其中在与w/5相邻的位置存在一个野败型不育系特有的读码框。该读码框由3个线粒体基因组DNA片段和1个来源不明的片段组成，编码一个352氨基酸的假定蛋白，本发明将其并命名为釆用PCR技术从野败型不育系扩增『J352基因，构建植物转化表达载体，并转化正常可育的水稻品种，发现获得的T。代转化体表现为花粉不育。将不育转化体与正常可育水稻杂交，获得的杂种中含有转基因的植株表现为花粉不育，不含转基因的植株表现为花粉育性正常。将该『A552表达载体转化双子叶植物拟南芥(」ra&Wo/w"Aa//a"a)，其转化体也同样产生雄性不育。因此，^4"2对不同植物产生雄性不育的效果，具有植物细胞质雄性不育活性。『J352基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其CDS为(454)...(1512)，编码352个氨基酸的蛋白质，其序列如序列表SEQIDN0.2所示。以『A552基因序列为探针，对多种水稻不育系进行RNA-blot杂交，发现它们表达出与野败型不育系相同的转录带型。进一步用『A552特异引物从各个不育系中，利用PCR扩增出产物并将所有产物测序，发现它们具有相同的『J352序列。应当理解，在不影响fE4352蛋白活性的前提下，本领域技术人员可对SEQIDNO:2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响^^52表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其活性片段的转化的植物细胞以及转基因植物。本发明提供的杂种育性基因具有重要的应用价值，可通过基因工程技术，如使用各种可控型启动子，构建『J352表达载体，转化各种植物培育雄性不育性系，用于杂交种子生产，培育植物不育系。本发明提供的不育基因的另一个应用是可以根据所述基因序列信息产生特异性分子标记，还可以用这些标记鉴定含有不育基因的栽培稻或野生稻，培育水稻不育系。图1、显示正常可育水稻品种93-11的线粒体基因组区域(上部)和野败型不育系珍汕97A的线粒体基因组对应的重组区域(下部)。图中各个点或片段的数字表示在93-11的线粒体基因组的碱基位置(上部)，或对应于93-11的线粒体基因组或染色体的碱基位置(下部)。股352下部的3条横线箭头表示mRNA。图2、显示『j"2蛋白序列。下划线表示预测的跨膜区。图3、显示用rp/5(A)和『v4352(B)为探针对各种水稻材料进行RNA-blot杂交，检测^4352的表达和恢复基因对它的调控。23A和97A为野败型不育系金23A和珍汕97A;97B和Nip为保持系珍汕97B和粳稻品种日本晴(Nipponbare);iy3，i/4,和//3〃i^分别为核基因组含有i/3，和//3〃^/4以及线粒体基因组含有fK4352的复育系ZSR1，SZR3，SZRll。所述的复育系是用不育系珍汕97A为母本，恢复系IR24为父本进行杂交，再用珍汕97A为轮回亲本回交多代选育的含有//3、i//、或//3〃^//的复育材料(Zhang等，1997,Theor.Appl.Genet.94:27-33)。图4、显示在大肠杆菌表达『J352产生致死。IPTG(isopropyl卩-D-1-thiogalactopyranoside)为诱导目的基因表达的诱导剂。图5、显示用于植物转化表达『J352的农杆菌双元载体的部分结构。图6、显示用图4所示的载体转化水稻和拟南芥产生雄性不育。(A)为非转化水稻对照的花药和可育花粉；(B)为To水稻转化体的花药和不育花粉;(C)为非转化拟南芥对照的花和体外培养萌发花粉；(D)为拟南芥T,转化体的花和体外培养不萌发花粉。图7、显示用^^52探针进行RNA-blot杂交，检测水稻T。不育转化体与野生型可育花粉杂交产生的杂种中，转基因的表达与雄性不育的共分离。S为不育株，F为可育株。图8、显示用『A552为探针对各种不同来源细胞质育成的水稻不育系进行RNA-blot杂交，检测是否有与野败不育系相同的)^4"2表达。数字1-7分别表示不育系G46A(冈型)，星A,D62A(D型)，D702A(D型)，K18A(K型)，华A(Y型)和优-IA(印水型)。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；使用的水稻材料为生产上广泛应用的，可从育种单位(如中国水稻研究所)获得的常见水稻品种。实施例l野败型细胞质雄性不育基因的发现及获得可育水稻细胞质的线粒体全基因组序列已被测定(Notsu等，2002,Mol.Genet.Genomics268，434-445;Tian等2006，PlantPhysiol.140，401-410)。本发明根据此序列设计43对引物对水稻野败型不育系珍汕97A和保持系珍汕97B以及粳稻品种日本晴(Nipponbare)的DNA进行PCR扩增；将所有的PCR产物作为探针，对珍汕97A，珍汕97B以及核基因组含有恢复基因i/3，和//3〃/^且线粒体基因组含有的复育系ZSR1，SZR3和SZR11进行RNA-blot杂交。所述的复育系是用珍汕97A为母本，恢复系IR24为父本进行杂交，再用珍汕97A为轮回亲本回交多代选育的含有i/3、、或//3〃///的复育材料(Zhang等，1997，Theor.Appl.Genet.94:27-33);并发现一个含有核糖体蛋白基因^/5的探针检出一种野败型不育系特异的mRNA,并且发现此mRNA受恢复基因7/Z的负调控。因此将r;/5及其附近区域作为进一步分析的目标。构建了一个野败型不育系线粒体基因组DNA文库，用rp/5探针以DNA印迹(DNA-blot)杂交筛选出2个阳性克隆。序列是以引物5'-atgtttccactccattttca-3，和5，-cttagtttccccctcatct-3，从水稻用PCR方法(94。C30s,6(TC60s,72。C60s,30循环)扩增获得。将这2个克隆测序分析，发现在叩/5下游存在一个15742bp的重组区，替代了保持系线粒体基因组相应的一个16462bp的区域。该重组区由7个不同来源的DNA片段组成，其中在与相邻的位置存在一个新的读码框(图1)。该读码框由3个线粒体基因组DNA片段和1个来源不明的片段组成，编码一个352氨基酸的假定蛋白，并命名为f^J52(图2)。^4W2有3个预测的跨膜区。实施例2f^4J52的表达调控用r尸/5和『^52为探针对珍汕97A，珍汕97B,复育系ZSR1，SZR3和SZR11进行RNA-blot杂交，检测『A352的表达及恢复基因对它的调控。序列是以引物5，-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3，和5，-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3，，用PCR技术(94。C30s，60。C60s,72。C60s,30循环)从珍汕97A扩增获得。结果显示，rp/5探针检测到1条mRNA，该mRNA水平在含有W/4的复育系下调(图3)。以『A352为探针检测到3条mRNA杂交带，其中最长的一条与rp/5检测到的mRNA相同，这3种mRNA的水平在含有//的复育系同样下调。用『A52为探针在保持系未检测到mRNA杂交带。实施例3『A552基因的功能验证用5'-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3'和5'-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3'{乍为引物，利用PCR技术从野败型不育系扩增『A552基因，克隆到大肠杆菌表达载体pThio-hisA(Invitrogen公司)。该载体在大肠杆菌表达产生致死(图4),表明『JJ52是1个具有植物细胞质雄性不育活性的毒蛋白。用5'-ggtttcactgcaggatgacgagaga-3'和5'-gtatagatggttacctacagcgctc-3'i"乍为引物，采用PCR技术从珍汕97A扩增出『A352基因片段，构建植物转化表达载体(图5)。用农杆菌介导法(Hiei等，1994,户/a"/J.6，271-282)转化正常可育水稻品种中花ll,获得的28个T。代转化体中，18个表现为花粉全不育，9个为部分不育(表l,图6)。将不育转化体与中花11杂交，获得的杂种中含有转基因的植株表现为花粉不育，不含转基因的植株表现为花粉育性正常(图7)。表1.WA352水稻转化体的育性分析To植株T-DNA插入数花粉育性结实率％1-101CS02-11cs02-21cs03-22PS15.23-61cs04-32PS20.24-71cs05-32PS3.15-52PS10.36-11cs06-21cs06-42PS6.9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注CS，PS,和FF分别指完全不育，部分不育，和可育。将该『A552表达载体转化拟南芥，其转化体同样产生雄性不育(图6)。因此，『」152对不同植物都产生雄性不育的效果，具有植物细胞质雄性不育活性。实施例4从其它类型的水稻细胞质雄性不育系检测『A352基因除了典型的野败型不育系，育种家们以不同的野生稻和籼稻材料为细胞质供体与栽培稻杂交和回交，育成多个孢子体不育类型的不育系，并命名为各种类型的不育系(朱英国，2000,水稻雄性不育的生物学，武汉大学出版社)，如冈型(Gambiaca)，印水型(ID),D型(Dissi)，K型，Y型等。本发明以弓l物5,-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3，禾口5'-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3，用PCR技术扩增获得的fE4352基因序列为探针，对水稻不育系G46A(冈型)，星A,D62A(D型)，D702A(D型)，K18A(K型)，华A(Y型)，和优-IA(印水型)进行RNA-blot杂交，发现它们表达出与野败型不育系相同的转录带型(图7)。进一步用所述引物从各个不育系中，利用PCR扩增出产物并将所有产物测序，发现它们具有SEQIDNO:l或SEQIDN0:2所示相同的序列。因此，这些不育系与典型的野败型不育系实际上含有相同起源的不育基因『A352。实施例5:从野生稻和栽培稻检测『A552基因使用5'-tcatgaattcatgacgagagatagaatg隱3'和5，-ttttgtcgaccttctctcagccatg-3'作为引物，釆用PCR技术从野生稻和栽培稻扩增『A552基因片段。实验结果发现132份普通野生稻材料中有3份含有fE4352基因；174份籼稻材料中有3份含有『A552基因。序列表<110>华南农业大学<120〉一种水稻细胞质雄性不育基因及其应用<130><150〉2008〗0112858.1〈15i〉2008-05-26〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.5〈210〉1<211〉1800<212〉腿<213〉稻属水稻品系珍汕97A〈220〉<221〉CDS〈222〉(454),(1512)<400〉1gcttagaacttgatagtcttctaatggctaaattggatgaagataatcaagccaagctca60tttactttgaattgaggaaggaaggggtaggggaatactaaatttcttaagatggttttg120taggtttctcatagcaaatagagacaccgaggccctctccacaacctagtagttgatggg180tatggatagaggcgagagagattgagtggagggttcgaatcgcaagattcctattggtgc240ggaaatgggtagaggtaaagcgaagcacagagaccagaccaccggatccccccttttcaa300ttgacatagtttgaccagtgaactccctgctgcgtgcaatagttgttccgaggacaatca360atgggtatata犯agaccaacgaaacgacgagtg卿鄉ataagggggagtagtaggag420gagctttcattgaagtagaggtttcatcgagtgatgacgagagatagaatgaga474MetThrArgAspArgMetArg15cgagcatttagtagtcgtteg522ArgAlaPheSerSerArgSer20cttaaateaetacaggagcga570LeuLysSerLeuGinGluArg35tegactatttatttttatatg618SerThrlieTyrPheTyrMet5055ttgaagatttecattttagtt666LeuLyslieSerlieLeuVal6570cccatagtacagatgttttec714ProlieValGinMetPheSer85cttattcttctttUtgcctt762LeulieLeuLeuPheCysLeu100caaageaagGinSerlieLys10getgggggggttAlaGlyGlyVal25aaa冊aaggataLysLysArglie40ttatgtattccaLeuCyslieProtttetagtctttPheLeuValPhe75cttetaacttgtLeuLeuThrCys90ggg卿gcgctttgcGlyArgAlaLeuCys15atetttaaagtagtgliePheLysValVal30agtagegaaatttegSerSerGlulieSer45tatttgatettctttTyrLeuliePhePhe60tateggatagtcetcTyrArglieValLeu80tgctectttcttattCysSerPheLeulie95attttgacctgtttgattcttttccgtttaaagaagaaggaggatttt810lieLeuThrCysLeulieLeuPheArgLeuLysLysLysGluAspPhe105110115gccteccctcctgaaagtataatetecatttttteaagtattttcget858AlaSerProProGluSerlielieSerliePheSerSerliePheAla120125130135attttgatggcagtattagcategggccctteagttgettacgetatg906lieLeuMetAlaValLeuAlaSerGlyProSerValAlaTyrAlaMet140145150gagaaccctgggcctagtgaagcgggtcctgaaggatecgetgcaccg954GluAsnProGlyProSerGluAlaGlyProGluGlySerAlaAlaPro155160165ccctegtectectttcaagaaageacgggggaaatggacgcgctgatg1002ProSerSerSerPheGinGluSerThrGlyGluMetAspAlaLeuMet170175180gcateaacgactccttecgcgccgeggacaccctecgggggggaacct1050AlaSerThrThrProSerAlaProArgThrProSerGlyGlyGluPro185190195teggtcaatcaaccgcttccaggggagcaagetatgcctcccgetctt1098SerValAsnGinProLeuProGlyGluGinAlaMetProProAlaLeu200205210215cccgttatgcaggaagetgetaateggtctccgccctacgcgccctac1146ProValMetGinGluAlaAlaAsnArgSerProProTyrAlaProTyr220225230ccgtatccagttgacgagataataggaggggatagegtgcaatecatt1194ProTyrProValAspGlulielieGlyGlyAspSerValGinSerlie235240245caaagaagacttttggggactaattggaatccttecgcccatgacatg1242GinArgArgLeuLeuGlyThrAsnTrpAsnProSerAlaHisAspMet250255260caaatgteceggattcaagcggaggatetatttgaactg肌agtggaa1290GinMetSerArglieGinAlaGluAspLeuPheGluLeuLysValGlu265270275ateataagaaagatggcgggcctgcatccaagtggcgattggatggga1338lielieArgLysMetAlaGlyLeuHisProSerGlyAspTrpMetGly280285290295tggggcgcgegggccttggacaacccccgtacggccactggcgaggaa1386TrpGlyAlaArgAlaLeuAspAsnProArgThrAlaThrGlyGluGlu300305310gacttggetaggttgcaccaaatgetcgacgacetacagageeggaat1434AspLeuAlaArgLeuHisGinMetLeuAspAspLeuGinSerArgAsn315320325gagcaateagetaccttctggcgcttggtcgaaagagtccgctt3egg1482GluGinSerAlaThrPheTrpArgLeuValGluArgValArgLeuArg330335340gcggatgaggatcsa朋cteagcctectagacatggctgag3gaagggtga肪AlaAspGluAspGinAsnSerAlaSer345350aaaaataattggaactattgagegctgtaggtatccatctatactaatagatataccgaggccctgcgtgcgccgtacgtaccgcctacgaa/taataggtagccccaccccaggcagagtttgtgagccgtgtaataggcgaccatttcgcgcggttcggggggcacttgaataagcegecggcccccggctgcgtctttacccctatccaatttttgggccaattccccettegtactaccaaaaaatgagattcttgccgaat<210〉2<211〉352<212〉PRT<213〉稻属水稻品系珍汕97A<400>2AspArgMetArgMetThrArgAlaLeuL.ysSerThr50LeuLys65ProlieLeulieLeuLysliePhe130ProSer145ProGluGlyGluThrProGinAla210SerProArgPheSer35lielieValLeuLys115SerValGlyMetSer195MetProSer20teuTyrSerGinLeu100LysSerAlaSerAsp180GlyProTyr5SerGinPhelieMet85PheGlulieTyrAla165AlaGlyProAlaArgGluTyrLeu70PheCysAspPheAla150AlaLeuGluAlaProSerArgMet55ValSerLeuPheAla135MetProMetProLeu215TyrGinSerAlaGly25Lys40LeuPheLeulieAla120lieGluProAlaSer200ProProLysCysLeuLeuLeu105Ser二euAsnSerSer185ValValTyrlie10GlyArglieValThr90ThrProMetProSer170ThrAsnMetProLysVallieProPhe75CysCysProAlaGly155SerThrGinGinValGlylieSerTyr60TyrCysLeuGluVal140ProPheProProGlu220AspArgPheSer45LeuArgSerlieSer125LeuSerGinSerLeu205AlaGluAlaLeuCys15ValLys30GlulieliePheCeu110lieAlaGluGluAla190ProAlaIJeliePheValLeu95PhelieSerAlaSer175ProGlyAsnlieValSerPheLeu80lieArgSerGlyGly160ThrArgGluArgGly153515951655171517751800<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>权利要求1、一种植物细胞质雄性不育基因，其编码一种具有植物细胞质雄性不育活性的蛋白，该蛋白序列为SEQIDNO2；或编码具有同等功能的由序列SEQIDNO2经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质蛋白序列。2、如权利要求l所述的基因，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。3、一种含有权利要求1或2所述基因的表达载体。4、一种由权利要求3所述载体转化的宿主细胞。5、权利要求l或2所述基因或权利要求3所述载体在植物育种中的应用。6、如权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。7、如权利要求5或6所述的应用，其特征在于1)将权利要求1或2所述基因或权利要求3所述载体转化植物获得转基因植物不育系；或利用l)获得的转基因不育系作为亲本杂交。8、根据权利要求1或2所述基因产生的分子标记。9、权利要求8所述分子标记在水稻育种中的应用。全文摘要本发明涉及植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种水稻细胞质雄性不育基因及其应用。本发明提供一种从水稻的线粒体基因组克隆的野败型杂交稻的细胞质雄性不育基因、其编码的蛋白质、含有所述基因DNA序列的载体及所述载体转化的宿主细胞。本发明的不育基因可通过基因工程技术，转化各种植物培育雄性不育性系，用于杂交种子生产，培育植物不育系；也可以根据所述基因序列信息产生特异性分子标记；还可以用这些标记鉴定含有不育基因的栽培稻或野生稻，培育水稻不育系。文档编号A01H5/00GK101514342SQ20081016702公开日2009年8月26日申请日期2008年10月9日优先权日2008年5月26日发明者刘振兰,刘耀光,珊叶,豪吴,张群宇,虹徐,郭晶心,陈远玲申请人:华南农业大学