专利名称：一种用于控制植物病原菌及其它植物病的储存稳定的杀菌甘草萃取物的生产方法
技术领域：
简单来说，本发明的目的在于通过喷洒储存稳定的植物甘草部份萃取物来控制农业中的真菌和/或细菌植物疾病。具体地讲，本发明涉及一种储存稳定的甘草植物成分萃取物的生产方法、该甘草萃取物抵抗植物病原真菌和/或抵抗植物病原细菌的用途以及一种用在农业中的杀菌剂。
背景技术：
真菌疾病是由许多无所不在的属于诸如细孢子菌属、子囊菌属、半知菌(有丝分裂孢真菌，不完美真菌)属以及担子菌属的真菌引起的。这些真菌是引起疾病问题并造成重大经济损失的主要真菌群。为了控制疾病常常大量使用合成杀菌剂。不过，这样做对生产者的收入及环境会造成重大冲击，而且不适合有机耕作。研究喷洒植物萃取物来控制真菌疾病及其它疾病传染媒介对农业来说已经非常普遍(特别是有机生产)。由虎杖属高山(Reynoutria sachclinensis)萃取物制成的商业产品Milsana 是植物萃取用于有机生产的一个成功例子，许多国家已能有效控制园艺及其它作物的白粉霉菌。不过，高效力抗真菌疾病的植物萃取物产品市场上尚未普及。有机作物生产与真菌控制结合主要来自铜化合物(杀菌剂)的使用。具体来讲，如果已经发生疾病，铜是现有降低疾病严重程度的唯一产品。不过，铜的毒性对环境有冲击，所以在农业生产中使用其它物质取代铜是紧迫的。由于铜的毒性，欧盟根据EEC规范2092/91限制单位用量的上限为2010kg/ha。抗菌成分组成的植物萃取物替代铜的使用，并且可以考虑这些替代物的经济及生态重要性。很显然，仍需要喷洒有效抵抗真菌疾病并可以结合有机作物生产的萃取物。所以， 本发明的目的是满足这样的需要。令人惊奇的是，本发明的申请人已经发现一种从甘草地上植物部份(优选干燥的植物部分)衍生的萃取物，可用来控制植物(例如，作物植物、观赏植物等)的病原真菌。喷洒萃取物(一次或重复喷洒)有效降低疾病的严重程度达数周。疾病减少的程度取决于萃取物浓度及感染压力。
发明内容
本发明的第一目的是一种生产储存稳定的甘草地上植物部份萃取物的方法。其中(a)将植物成分减小成小片，(b)向尺寸减小的植物成分添加溶液以萃取植物成分中的活性成分，其中使用的溶剂是水和/或有机溶剂，(C)在溶剂中富集活性成分(萃取)及(d)将含残留少量活性成分的植物成分与含活性成分的溶剂分离。甘草衍生的植物萃取物作为抗菌萃取物使用并适合用于农业生产。
本发明具有利用喷洒植物萃取物控制真菌疾病的优点。另外，铜被从植物萃取的新活性物质取代的趋势可能成为农业生产的重大利益。名词“植物成分”就甘草而言是指植物的部份，特别是地上的植物部份，例如叶子。 具体来讲，是干燥的植物部份(例如室温)。优选地通过将植物成分研磨成均勻粉末来实现尺寸的减小。然后从粉末制成萃取物。地上植物成分较理想减小的尺寸小于1mm，更理想小于0. 1mm。植物成分的减小例如可以使用电磨机完成。尺寸减小的植物成分(具体来讲是粉末)，使用水和/或有机溶剂萃取。优选地， 有机溶剂是极性有机溶剂。具体来讲，有机溶剂选自于由酮(例如丙酮、丁酮)、醇(例如乙醇、甲醇、丙醇)、酯(例如醋酸乙酯)及卤代烃(例如二氯甲烷、三氯甲烷)组成的组中。 更优选地，使用含水有机溶剂(例如含水丙酮、含水二甲砜、含水醋酸乙酯、含水醇、优选的是含水乙醇)萃取。根据本发明，使用1至50倍的水和/或水-有机溶剂混合物萃取尺寸减小的植物成分。如果使用含水有机溶剂，根据本发明有机溶剂与水的体积比在10 1和1 100 之间，优选地在为1 1和1 10之间，更优选地大约为1 4。水和/或水-有机溶剂混合物加入尺寸减小的植物成分的温度约为20°C。根据本发明的优选实施例，用水和/或水-有机溶剂混合物萃取时间约为1小时至20小时，其中系统温度逐渐上升至约30°C至80°C。使用Soxhlet萃取器通过渗滤或迷宫混流方法萃取。特别优选的是这样的实施例，即其中水溶液搅拌约30分钟，然后放置1小时至3 小时沉淀。根据本发明的另一优选实施例，使用清水和/或含有残留(步骤(b)及(C))的水-有机溶剂混合物萃取，并重复直到约90%的生物活性以液态呈现。本文使用的名词“生物活性”表示生物活性是指作为杀菌剂的活性。原始产生的萃取物可以浓缩并储存。与新鲜制备的萃取物相比，在4°C储存9个月的萃取物的效力稍微减弱。所以，根据本发明的另一方面，通过在步骤(d)之后减少溶剂的体积到1/2至 1/20，来浓缩含活性成分的溶剂。喷洒溶液的理想浓度可以通过向原始萃取物加水来调整。具体来讲，喷洒前浓缩的萃取物用水稀释的比例在1 5和1 200之间，最好在1 10和1 100之间。根据本发明的优选实施例，含活性成分的溶剂可以通过添加乳化剂、植物油和/ 或水制成。此外，萃取物可以通过在喷洒之前向其添加黏稠剂或其它适合的植物保护剂(例如Trifolio S-forte)混合而成。根据本发明的第二方面，使用甘草萃取物作为杀真菌剂和/或作为杀细菌剂。所以，萃取物用来抵抗植物病原真菌，具体来讲，抵抗作物的霜霉病，和/或抵抗植物病原细菌。甘草萃取物可以用来抵抗导致疾病问题的所有主要真菌群，例如属于细孢子菌、子囊菌、半知菌(有丝分裂孢真菌，不完美真菌)以及担子菌的真菌。
根据本发明的第三方面，提供了农业使用的商业杀真菌剂，所述杀真菌剂含有(a) 甘草萃取物、(b)非活性载体和(C)表面活性剂。虽然仅在此具体示出并描述了优选实施例，但是应该理解的是，在不脱离本发明的精神和预定范围的情况下，根据上述说明并在所附权利要求的范围内，可以对本发明做出许多修改和改变。
具体实施例方式实施例1 抵抗霜霉病的有效性在室温将甘草的地上部份干燥，然后放入电磨机研磨成为均勻的粉末。萃取物的制造利用Soxhlet萃取器将50g粉末加入IL含水乙醇萃取5小时完成。原始的乙醇萃取物用1 5比例的水稀释。所得的喷洒产品为(w/v)溶液，该溶液含有1% (w/v)甘草、20% (ν/ν)乙醇和80% (ν/ν)水。喷洒前可以添加任何通用的黏着剂，以增加溶液的性能并获得更好的结果。甘草萃取物能有效抵抗霜霉病。例如，有效抵抗由晚疫病菌造成的西红柿的霜霉病及由黄瓜霜霉病菌(P.cubensis)造成黄瓜的霜霉病。事实上，与没处理的植物相比，经甘草萃取物处理的植物的疾病严重程度大幅降低。作物耐受甘草萃取物喷洒而没有负面影响。根据这种结果，植物萃取物的商业生产(配制产品)似乎可行。实施例2 抵抗蕃茄的晚疫病菌(晚疫病)的有效性甘草乙醇萃取物1 % (w/v)每14和20天一次喷洒在蕃茄植物上。当植物的第5 叶发展完全时开始喷洒，直到流出(rim off)。另外，以a)乙醇和去离子水1 1 (ν/ν)混合物，以及b)注册杀菌剂Fosetal WPG00g/i00L)喷洒相同数量的植物。在第一次喷洒溶剂后使用由晚疫病菌衍生的游动孢子囊浮悬液人工接种植物。将植物保存在温室内直到疾病程度评估。接种后7天开始评估疾病程序，然后每2至3天重复评估一次(总数11次)。结果显示与对照植物相比，在所有喷洒周期(接种后0天、14天、及20天)植物的晚疫病严重程度因使用植物萃取物已经大幅降低(疾病减少74%、97%至95% )。疾病降低的程度与喷洒商业杀菌剂的结果匹敌。实施例3 抵抗温室豆类的豆锈病菌(豆锈病)的有效性试验1 萃取程序使用电磨机将甘草叶磨成粉末。将200g粉末与2L 70%乙醇/30%水混合，并且以60°C蒸馏2小时。然后过滤萃取物并以4°C储存。植物处理在温室中用0、0.2%和(参考干甘草粉)的水溶液喷洒处理4株植物。蒸馏萃取物用水及0.2%Trifolio S-fOrte(注册的植物保护剂、黏着剂及渗透剂)稀释。 (g/v)衍生溶液含(w/v)甘草、7% (ν/ν)乙醇及93% (ν/ν)水。2% (g/v)衍生溶液含 0. 2% (w/v)甘草、1.4% (ν/ν)乙醇及 98. 6% (ν/ν)水。处理后M小时，使用含75mg/l孢子的豆锈病菌的孢子悬浮液人工感染植物。MM对植物感染度监控3周。在未处理的对照组中豆类的感染度为9%，在0.2%和的处理组中感染度分别为2. 2%及1. 9%，相应于75%和79%的效力(根据Abbott)。试验2 萃取稈序将甘草叶磨成粉末。在Soxhlet萃取器中将200g植物材料用2L 96%乙醇萃取 10小时(温度约60°C )。然后用旋转蒸发器使溶剂蒸发至大约200ml。浓缩溶液再用96% 乙醇溶解，得到总量400ml，相当于萃取浓度50%。使用前将萃取物储存在冰箱内。使用时再用去离子水稀释。棺物处理每批试验使用浓缩甘草萃取物(浓度0.31%、0. 63%、1.25%、2. 5%和5%)喷洒处理3株植物直到甘草萃取物流出。第二天用夏孢子(U. appendiculatus)浓度为lmg/ml 的0.0125% Tween 20悬浮液接种植物。植物放在20°C保湿箱内过夜。然后移到温室。14 天后计算上部叶表面3x1cm2的疱(pustule)数。MM1.用5%甘草萃取物处理豆类培育植物“Primula”，获得86. 3%的效力。为了比较，对水处理植物上的每平方厘米上的疱计数，有9个疱。而用0. 63%甘草萃取物处理后效力为45%。所有萃取处理都与对照显著不同。2.用5%甘草萃取物处理培育植物“Hildora”，获得91. 0%的效力。喷洒1. 25% 萃取物获得59. 6%的效力(对照的疱数约为13/cm2)。与对照组相比，除0. 31 %的浓度以外，所有浓度的萃取物均大幅减少感染。实施例4 抵抗田里黄瓜的白粉病(powdery mildew)的有效性萃取程序将甘草叶磨成粉末。在Soxhlet萃取器中将200g植物材料用2L的96%乙醇萃取10小时(温度约60°C )。然后用旋转蒸发器将溶剂蒸发至200ml。浓缩溶液再用96% 乙醇溶解，得到总量400ml，相当于萃取浓度50%。使用前将萃取物储存在冰箱内。使用时再用去离子水稀释。植物处理黄瓜植物每14天处理(喷洒直到流出)3次，当植物出现6-8片叶子且出现第一个白粉病症状时开始处理。将植物分成3组第1组保持未经处理；第2组用2%萃取物水溶液(含 0. 2%Trifolio S-forte)处理，第 3 组用 4% 的含 0. 2%Trifolio S-forte 的水溶液处理。MM未处理对照的感染度为55%，并且2%浓度处理的感染度为19%，4%浓度处理的感染度为10%。这样的结果分别相当于63%和79%的效力。实施例 5:黄瓜的白粉病(Pseudoperonospora cubensis)萃取程序将甘草叶磨成粉末。在Soxhlet萃取器中将200g植物材料用2L的96%乙醇萃取10小时(温度约60°C )。然后用旋转蒸发器将溶剂蒸发至200ml。浓缩溶液再用96% 乙醇溶解，得到总量400ml，相当于萃取浓度50%。使用前将萃取物储存在冰箱内。使用时再用去离子水稀释。
棺物处理1.盆栽植物试验每批试验向4至8株黄瓜植物喷洒甘草萃取物类(浓度0.31%、0. 63%、1.25%、 2. 5%及5% )。第二天用瓜类霜霉菌(P. cubensis)孢子囊浓度为&1θ7πι1的去离子水悬浮液接种。植物放在15°C无灯保湿箱内过夜。然后移到室温箱。14天后评估感染叶子的面积。2.聚乙烯隧道试验使黄瓜植物生长在聚乙烯隧道，做四组平行生长，每次平行生长包括4株植物。植物每周喷洒5%甘草萃取物并且每次人工感染P. cubensis。评估每组平行生长中的3株植物中每株植物的12片叶子上感染面积的百分比。当发现白粉病第一个症状后开始作疾病评分。每周作一次(总共9次)。MM1.盆栽植物试验用5%甘草萃取物处理黄瓜获得95. 3%效力。EC5tl-值为0. 5，表示0. 5 %萃取物浓度产生50%效力。2.聚乙烯隧道试验用5%甘草萃取物处理黄瓜保持很低的P. cubensis感染率，试验结束时获得 77. 7%的效力。与此同时，对照植物显示的感染率为92%。实施例6 病原细菌(番茄细菌性溃疡病菌和花草黄单胞菌)萃取程序(见实施例5)试管分析使用胰酶大豆琼脂分析番茄细菌性溃疡病菌(Clavikicter michiganinsis)，使用碳酸钙琼脂分析花草黄单胞菌(Xanthomonas hortorum)。用每种浓度的IOOul细菌悬浮液接种每种菌的10个培养皿(Petri dish)。然后用消毒软木塞对琼脂钻孔。每孔施加 50ul甘草萃取物(浓度0. 31%、0. 63%、1. 25%、2. 5%和5% )。将培养皿以存放2至 5天。然后测量抑制带。MM1.与水对照相比，所有检测的萃取物浓度显示出对番茄细菌性溃疡病菌的生长抑制。抑制带的范围从7. 9em(0. 5%萃取物浓度)至2. Iem(0. 31%萃取物浓度)。2.浓度5%至1.25%的抵抗花草黄单胞菌的甘草萃取物造成抑制带的范围从 4. 4cm 至 1. 25cm。3.在所有试验中水对照都没有抑制带。实施例7 以胡萝卜链格孢菌(Alternaria dauci)和胡萝卜黑斑病菌 (A.radicina)感染的胡萝卜萃取程序(见实施例5)用10%甘草萃取物浸泡被胡萝卜链格孢菌(Alternaria dauci)和胡萝卜黑斑病菌(A.radiCina)感染的胡萝卜种子并搅拌30分钟。然后种子在室温干燥过夜。第二天将 3x100种子播种在容器内，19天后长出幼苗。结果
在第一试验中，使用10%甘草萃取物处理种子使健康胡萝卜幼苗从15. 7% (对照组)增加到32.7% (含萃取物处理种子的实验组)。同时，与对照相比，生长幼苗受到感染的比例减小。虽然总生长百分率对于实际应用还太低，但是从结果看很有希望，并且优化的甘草萃取程序会产生更高的效力。
权利要求
1.一种储存稳定的甘草地上植物成分萃取物的生产方法，其中(a)将植物成分减小成小片，(b)向尺寸减小的植物成分添加溶液以萃取植物成分中的活性成分，其中使用的溶剂是水和/或有机溶剂，(c)在溶剂中富集活性成分，及(d)将含残留少量活性成分的植物成分与含活性成分的溶剂分离。
2.如权利要求1所述的方法，其中，使用1至50倍的水和/或水-有机溶剂混合物萃取所述尺寸减小的植物成分。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述水和/或水-有机溶剂混合物加入尺寸减小的植物成分的温度为20°C。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，用水和/或水-有机溶剂混合物萃取时间为1 小时至20小时，其中系统温度逐渐上升至30°C至80°C。
5.如权利要求4所述的方法，其中，水溶液搅拌30分钟，然后放置1小时至3小时沉淀。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，使用清水和/或含有残留的水-有机溶剂混合物萃取，并重复直到90%的生物活性以液态呈现。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述有机溶剂与水的体积比在10 1 和1 100之间，优选地为1 4。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，有机溶剂选自于由酮、醇、酯及卤代烃组成的组中。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，通过在步骤(d)之后减少溶剂的体积到1/2至1/20，来浓缩含活性成分的溶剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中，喷洒前浓缩的萃取物用水稀释的比例在1 5和 1 200之间。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中，在喷洒之前添加黏着剂或其它适合的植物添加剂。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，含活性成分的溶剂通过添加乳化剂、植物油和/或水制成。
13.—种如权利要求1至12中任一项所述的抵抗植物病原真菌的甘草萃取物的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述用途是抵抗作物的霜霉病。
15.一种如权利要求1至12中任一项所述的抵抗植物病原细菌的甘草萃取物的用途。
16.一种用在农业中的商业杀菌剂，所述杀菌剂包括(a)甘草萃取物、(b)无活性载体和(C)表面活性剂。
全文摘要
农作物的植物病导致农业及观赏植物生产及公共环境绿化的重大经济损失。疾病的有效管理及控制是农业生产的重要问题及挑战。喷洒甘草植物地上部份衍生的萃取物以降低及控制植物感染程度。甘草植物萃取物的抗菌性能有效减少植物疾病。农作物植物喷洒该萃取物表明另外一种新的管理病菌感染的方法。本发明揭露一种具有抗菌性质的新萃取物。
文档编号A01N65/00GK102176831SQ200880024885
公开日2011年9月7日 申请日期2008年7月17日 优先权日2007年7月18日
发明者安内格雷特·施密特, 斯达柔拉·康斯坦丁尼多-督特熙尼斯, 朱莉娅·润特, 胡贝图斯·克林贝葛, 西尔维亚·思娇尔 申请人:德国特立福利公司,生物材料的生产和销售部门