专利名称：：一类新型保幼激素合成抑制剂－苯丙-甘-亮三肽酰胺类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类全新结构的保幼激素抑制剂——苯丙-甘-亮三肽酰胺类似物。技术背景昆虫神经肽是由昆虫脑内特异性神经分泌细胞周期性地合成、分泌并通过神经或体液传递的一类活性小肽。昆虫神经肽相互协调，控制和调节着昆虫某些器官或腺体的活动，影响昆虫的生长、发育、变态、生殖和代谢等重要的生理过程。近三十年来，随着化学和生物学的发展，尤其是先进的分析测试手段的广泛应用，人们发现了大量的昆虫神经肽，如促前胸腺素(prothoracicotropichormone,PTTH)、抑前胸腺肽(prothoracicostaticpeptide,PTSP)、促咽侧体素(allatotropin,AT)、抑咽侧体素(allatostatin，AST)、滞育激素(di即ausehormone,DH)、性信息素合成激活肽(pheromonebiosynthesisactivatingneurop印tide，PBAN)、羽化激素(eclosionhormone,EH)等。昆虫神经肽作为昆虫激素的一种，具有极高的生理活性。抑咽侧体素(Allatostatin，简称AST)是一类最早从蜚蠊中分离得到的具有抑制咽侧体合成保幼激素功能的昆虫神经肽，AST从结构功能上可分为三类A型AST是首先从蟑螂中分离得到的一类抑咽侧体素，其结构特征是C末端为Y/FXFGL-,2结构；B型AST首先从蟋蟀中分离得到，C末端为W(X)J-NH2;从烟草天蛾ManducaSexta中得到的AST被认为是C型AST。这三类肽中，A型AST的研究最多，大量的数据表明高度保守的C末端Y/FXFGL-NH2是关键的活性片断。在蟑螂体内，A型AST以皮摩尔级别高效地抑制保幼激素的合成，从而起到调控蟑螂生长发育的功能。尽管抑咽侧体素具有很高的体外抑制保幼激素合成的生物活性，但是它具有活体活性差，容易被降解，合成成本高等缺点，迄今尚未在害虫治理中得到实际应用(GarsideCS,NachmanRJ，TobeSS.InjectionofDip-allatostatinorDip-allatostatinpseudopeptidesintomatedfemaleZ)^/o;fen7/w"ctotoinhibitsendogenousratesofJHbiosynthesisandbasaloocytegrowth.InsectBiochemMolBiol2000;30:703-710.)。为了克服天然多肽的种种缺陷，许多研究者对其结构进行修饰改造，发现了一些具有较好活性的AST类似物。现有一些A型AST类似物公开于下列文献中如1994年Hayes等(Structure-activitystudiesofallatostatin4ontheinhibitionofjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallata:theimportanceofindividualsidechainsandstereochemistry.P印tides1994,15，1165-1171.)，1998年Nachman等(Synthesis,biologicalactivity,andconformationalstudiesofinsectallatostatinneuropeptideanaloguesincorporatingturn-promotingmoieties.Bioorg.Med.Chem.1998,6,1379-1388.)，1997年Piulachs等(KetomethyleneandmethyleneaminopseudopeptideanaloguesofinsectallatostatinsinhibitjuvenilehormoneandvitellogeninproductioninthecockroachBlattellagermanica.InsectBiochem.Molec.Biol.1997，27，851-858.)，1999年Nachman等(Hemolymphandtissue-boundpeptidase-resistantanalogsoftheinsectallatostatins.Peptides1999，20，23-29.)，1991年Feyereisen等(Allatostatinswhichinhibitinsectjuvenilehormonebiosynthesis.美国专利US5039792),2007年Nachman等(Mimeticinsectallatostatinanalogsforinsectcontrol.美国专利US7208476B2)。这些文献通过模拟肽学对AST进行结构改造，大部分类似物的结构比较复杂(模拟了五肽以上的活性肽)，合成成本高，不适合作为新农药进行开发。本发明正是针对上述缺点，从A型AST的结构特点出发，开发了一系列小分子模拟肽类化合物，并发现它们对蟑螂的保^J激素合成具有较好的抑制活性。
发明内容现有的文献报道认为抑咽侧体素的核心五肽Y/FXFGLa是产生生物活性必要的片段。本发明仅以C-末端三肽Phe-Gly-Leu-NH2为先导物，釆用酪氨酸、芳香酸等替代先导结构中的苯丙氨酸和甘氨酸的方法，得到一类结构新颖的保幼激素合成抑制剂，其结构通式为式B:R-Leu-NH2式B式B中，R为Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH2CH2CO-Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，Ph(CH2)5CO-,Ph(CH2)4C0-，PhCH2NHC0(CH2)2C0-，PhCH2NHC0(CH2)3C0-，PhCHWHCOCH^O-。优选的式B化合物，其中R为Phe-Gly-,PhCH2CH2C0-Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，PhCH2NHCO(CH2)2C0-。本发明所提供的式B化合物，均按照多肽固相合成法得到(参考文献ChanWG,WhitePD.FmocsolidphasepeptidesynthesisAPracticalApproach,OxfordUniversityPress,2000;p.9-74.)。本发明采用Tobe等人的离体放射化学测定方法(a.Tobe，S.S.;Clarke,N.Theeffectof^-methionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachDiplopterapunctata.InsectBiochem.1985，15，175-179.b.Tobe,S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.Biochem.J.1974，144，107-113.)，测定了式B化合物抑制太平洋折翅蠊(历'p7optera/W77Cte^)保幼激素合成的离体活性。本发明进一步采用体表测试方法，测试了部分化合物对太平洋折翅蠊(Z^^o/^erap"""s&)的活体活性。生测结果表明，部分式B化合物在活体水平上可以高效地抑制蟑螂保幼激素的合成。另外，本发明还测试了部分式B化合物对蟑螂卵发育的影响。结果发现经式B化合物处理的蟑螂，卵的发育明显受到抑制。正常情况下，第七天卵发育成熟；而经式B化合物处理的虫子的卵发育缓慢。以本发明的式B化合物为活性成分的防治蟑螂的药物也属于本发明的保护范围。在需要的时候，在所述药物中还可以加入一种或多种农药制剂中可接受的载体，所述载体包括农药制剂中常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等。制成的药物的剂型也是多样的，可以是粉剂、微乳剂、佴剂、微胶囊剂、乳油等。本发明以A型AST的Phe-Gly-Leu-NH2片段为先导物，设计合成了一类新颖的保幼激素合成抑制剂。化合物分子量在300左右，远远低于天然的抑咽側体素和前人所制备的类似物，结构很简单。这类化合物对蟑螂的保幼激素合成具有较好的抑制活性，进一步的应用研究表明，该类化合物明显影响雌性蟑螂的生殖系统，抑制蟑螂卵的生成。符合昆虫生长调节剂的特性，具有很好的开发应用前景。图l、化合物B7的活体活性(体表测试)。图2、化合物B7对蟑螂卵的发育影响。具体实施例方式本发明可用以下实施例作进一步详细说明，但本发明并不仅限于这些实施例。制备实施例l、Bl化合物的合成(1)树脂活化称取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶涨活化3h，DMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s试剂检测。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFmoc-Leu-0H(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgH0Bt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser'si式剂检测。(3)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-OH，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15tnlDMF,室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5ralDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(4)接Phe:DMF洗3次，加入116mgF腦-Phe-OH,114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF,室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(5)切割、解侧链保护基产物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OmlTFA，室温搅拌2.5h，溶液由黄色变为红色，过滤，N2吹去TFA，加入30ml冷的无水乙醚，4000N/min离心5min，得白色沉淀，30ml冷的无水乙醚如此洗3次，真空干燥，质谱检测。质谱检测结果MH+:335.2。(6)粗肽用HPLC分离纯化。色谱柱为C18半制备柱。收集的溶液脱去乙腈后，冻干制得纯肽。化合物B2按上述方法制备。制备实施例2、B4化合物的合成(1)树脂活化称取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶涨活化3h，DMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s试剂检测。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFmoc-Leu-OH(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgHOBt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(3)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-0H，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌淀DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(4)接苯基丙烯酸:DMF洗3次，加入45mg苯基丙烯酸，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s试剂检测。(5)切割、解侧链保护基产物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OtnlTFA，室温搅拌2.5h，溶液由黄色变为红色，过滤，N2吹去TFA，加入30ml冷的无水乙醚，4000N/min离心5min，得白色沉淀，30ml冷的无水乙醚如此洗3次，真空干燥，质谱检测。质谱检测结果隨a':340.0。(6)粗肽用HPLC分离纯化。色谱柱为C18半制备柱。收集的溶液脱去乙腈后，冻千制得纯肽。化合物B3，B5，B6均按上述方法制备。制备实施例3、B7化合物的合成(1)树脂活化称取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶涨活化3h,DMF洗4次，加入20M哌卩定DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFtnoc-Leu-OH(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgHOBt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切害ij20min，5tnlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s试剂检测。(3)接丁二酸酐DMF洗3次，加入30mg丁二酸酐、37mg的DMPA，溶于15ralDMF，室温搅拌2h,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(4)接苄胺DMF洗3次，加入3倍量苄胺，114mgHBTU,41mgHOBt,105ulDIEA，溶于15mlDMF,室温搅拌2h，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's试剂检测。(5)切割、解侧链保护基:产物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OmlTFA，室温搅拌2.5h,溶液由黄色变为红色，过滤，N2吹去TFA，加入30ml冷的无水乙醚，4000N/min离心5min，得白色沉淀，30ml冷的无水乙醚如此洗3次，真空干燥，质谱检测。质谱检测结果MH+:320.2。(6)粗肽用HPLC分离纯化。色谱柱为C18半制备柱。收集的溶液脱去乙腈后，冻干制得纯肽。化合物B8，B9均按上述方法制备。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>所有式B化合物的结构、质谱数据和物理性状列于表l中。_表l、式B化合物的结构、质谱结果及其物理性状<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>应用实施例l、化合物的离体活性本发明采用Tobe等人的离体放射化学测定方法(参考:a.Tobe,S.S.;Clarke,N.TheeffectofL-methionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachZj》7o/7terai/sectA'oc力e瓜1985，15，175-179.b.Tobe，S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.A'oc力e瓜/.1974,144,107-113.)，测定了式A化合物抑制太平洋折翅蠊(历Wopterap"/cta^)保幼激素合成的离体活性。部分化合物离体生测结果见表2。表2、部分式B〗七合物的离体活性结构IC50BlPhe~Gly-Leu-NH22.06liMB3Ph^^^^^^Gly-Leu-NH20.86uMB4Ph^^^Gly-Leu-NH2B7▽丫Leu-NH200.48uM表2结果表明，式B化合物具有抑制蟑螂保幼激素合成的能力。B1，B3，B4和B7的ICs。值分别为2.06liM，0.86txM，1.01yM和0.48uM。数据表明，B3，B4和B7的离体活性均优于先导物B1。应用实施例2、体表测试方法测定化合物的活体活性。配制100uM的类似物的DMS0溶液；并与丙酮配制成混合溶液(比例l:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌虫，成虫羽化当天)(每头试虫的施药量为O.lnmol)，将蟑螂置于27'C，湿度80%，充足食物和水，无光的环境下培养到第三天；采用离体放射化学测定方法测定受试蟑螂合成保幼激素的能力。图1为化合物B7的活体活性结果。所有结果用t检验方法统计。其中，***为P〈0.001;柱形图上数字n为重复次数。图1结果表明，在每头试虫施药量为0.lnmol的条件下，化合物B7显著抑制了蟑螂保幼激素的合成。t检验方法统计的结果发现它们的P值为0.0005，低于0.001。应用实施例3、化合物对蟑螂卵的发育影响。配制100yM的化合物B7的DMSO溶液，再与丙酮配制成混合溶液(比例1:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌虫，成虫羽化当天)，将蟑螂置于27'C，湿度80%，充足食物和水，无光的环境下培养。每天检查蟑螂卵巢的发育情况，测量卵母细胞的长度。化合物B7对蟑螂卵的发育抑制结果见图2.从图2可以看出，与溶剂DMSO对照相比，B7处理的蟑螂的卵发育速度降低，说明B7抑制了蟑螂卵的发育。权利要求1、一类结构新颖的保幼激素合成抑制剂，该类抑制剂是苯丙-甘-亮三肽酰胺类似物，其通式结构为式BR-Leu-NH2式B式B中，R为Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH2CH2CO-Gly-，PhCH＝CHCO-Gly-，Ph(CH2)5CO-，Ph(CH2)4CO-，PhCH2NHCO(CH2)2CO-，PhCH2NHCO(CH2)3CO-，PhCH2NHCOCH2CO-。2、权利要求1中所述式B化合物中，优选的式B化合物为R:Phe-Gly-，PhCH2CH2C0_Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，PhCH2NHC0(CH2)2C0-。3、权利要求l所述的化合物的制备方法。4、权利要求l所述化合物在蟑螂防治中的应用。5、以权利要求l所述化合物为活性成分的药物。6、根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述药物是用于防治蟑螂的药物。全文摘要本发明公开了一类结构新颖的保幼激素合成抑制剂，该类抑制剂是苯丙-甘-亮三肽酰胺类似物，本发明所提供的化合物结构通式为式BR-Leu-NH<sub>2</sub>式B中，R为Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CO-Gly-，PhCH＝CHCO-Gly-，Ph(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>CO-，Ph(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>CO-，PhCH<sub>2</sub>NHCO(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CO-，PhCH<sub>2</sub>NHCO(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>CO-，PhCH<sub>2</sub>NHCOCH<sub>2</sub>CO-。本发明的式B化合物模拟了A型AST的Phe-Gly-Leu-NH<sub>2</sub>片段的化学结构，具有结构简单，合成成本低的特点；这类化合物对蟑螂的保幼激素合成具有较好的抑制活性，进一步的应用研究表明，该类化合物明显影响雌性蟑螂的生殖系统，抑制蟑螂卵的生成。符合昆虫生长调节剂的特性，具有很好的开发应用前景。文档编号A01P23/00GK101519430SQ20091008061公开日2009年9月2日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者云凌,开振鹏,张金蕊,斯蒂芬.斯.陶博,杨新玲,勇谢,陈馥衡,娟黄申请人:中国农业大学