专利名称：：利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法
技术领域：
：本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种利植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法。
背景技术：
：铝是自然界含量最多的金属元素,占地壳总质量的7%。其中大部分在土壤中以氧化铝、硅化钼的形式存在，对植物的生长不够成伤害。当土壤溶液酸化后(p!K5),铝就会从氧化物或硅酸盐中释放出来，溶解到土壤中，主要以A产形式存在。A产对植物的胁迫最大，甚至低浓度(pmol/L)铝离子在酸性条件下就能对植物产生毒害效应[Horstetal.Effectofaluminumonrootgrowth,cell-divisionrateandmineralelementcontentsinrootsofimgw'cw/atofgenotypes.ZPflanzenphysiol,1983，109:95-103;KinraideandParker,Assessingthephytotoxicityofmononuclearhydroxyl-aluminum.PlantcellEnviron,1989,12:479-487]。铝毒最明显的特征是抑制根的生长，造成植物对水分和营养吸收的困难[KochinaLV，Cellularmechanismsofaluminumtoxicityandresistanceinplants.AnnuRevPlantPhysiol.PlantMolBiol,1995，46:237-260;Clarkson，ClarksonDT.Theeffectofaluminumandsomeothertrivalentmetalcationsoncelldivisionintherootapicesof爿〃/wmcepa.AnnBot,1965,29:309-315]。研究者对铝诱导植物抗性基因的表达做了大量的研究。Richard和S丽den[RichardsKDetal.Wali6andWali7.Plantphysiol1994,105:1455-1456;SnowdenKCandGardnerRC.Fivegenesinducedbyaluminuminwheat(7HZ/c謂ae劝'v應L,)roots.PlantPhysiol,1993,103:855-861]从铝敏感小麦中分离得到了7个铝诱导基因，命名wali基因(forwheataluminuminduced)。这些基因编码的蛋白分别与植物类金属硫蛋白(walil)、苯丙氨酸解氨酶(wali4)，蛋白酶抑制剂〔wali3,wali5和wali6)及谷氨酰胺合成酶(wali7)具有同源性。另外还有十几个铝诱导的基因已被分离出来，包括小麦、拟南芥和烟草中的各种基因。为了研究植物抗铝性的机理，人们利用了转基因技术。DelaFuente等(1997)将细菌(Pseudomonasaeniginosa)的梓檬酸合成酶基因(CS)在烟草中过量表达，结果转基因烟草的耐铝能力增强，这是人类首次釆用转基因技术提高植物耐铝特性的尝试[delaFuenteJMetal.Aluminumtoleranceintransgenicplantsbyalterationofcitratesynthesis.Science,1997，276:1566-1568]。Anoop等(2003)将拟南芥的线粒体柠檬酸合酶CS基因导入油菜中并得到过量表达，结果转基因植株中CS活性提高，植株的耐铝能力增加[AnoopVMetal.Modulationofcitratemetabolismalteraluminumtoleranceinyeastandtransgeniccanolaofoverexpressingamitochondrialcitratesynthase.PlantPhysiol，2003，132:2205-2217]。Delhaize等(2004)将小麦根尖苹果酸分泌的转运蛋白基因ALMT1在大麦中异源表达，转ALMT1基因的大麦植株其苹果酸分泌的能力和耐铝能力都有显著提高[DelhaizeEetal.Engineeringhigh-levelaluminumtoleranceinbarleywiththeALMT1gene.PlantBiol,2004，101:15249-15254]。cDNA，称之为Si69基因，它来自于谷子未成熟种子的cDNA文库，该cDNA与植物抗铝性有关，
发明内容本发明目的是提供一种利用植物受铝诱导的基因来提高植物抗铝性的方法。本发明从谷子(&to〃'a/to//caBeauv.Var.3661，3662)未成熟种子cDNA文库中筛选得到一个cDNA克隆，称之为Si69基因。该cDNA的序列长度为1061bp，为双链核酸类型，线性，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。通过三大数据库的检索，发现Si69cDNA编码蛋白与水稻(NP—001051238AAP12992)、拟南芥(NP—188925NP—199196)、小盐芥(AAM19711)和小麦(AAC37416.1)同源性分别为84%,58%,50%，50%。它们都具有一共同特点蛋白结构中存在一保守的wali7结构域，但功能未知。Southern印迹研究表明该基因在谷子基因组中以单拷贝存在。Northern印迹分析5V砂基因的表达模式，表明其在谷子谷子幼苗、根、茎、叶、幼穗及未成熟种子等组织中均可检测到其转录产物的存在。RT-PCR和荧光定量PCR研究表明^'"基因的表达受到铝的诱导。进一步，本发明构建含Si69的表达载体，并将其转化植物，用以考察转基因植物的抗铝性。在本发明实施方案中，构建了含有S/McDNA的拟南芥表达载体，其表达盒是由花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素嫌酸转移酶II(NPTII)。所述的表达载体优选的是重组质粒pBI121-Si69，其中S/仰cDNA正向插入并且在35S启动子驱动下。本发明将上述含有所述&69cDNA的重组表达载体转化植物，如拟南芥，获得了抗铝性提高的转基因植物。在本发明实施方案中，将含有所述cDNA的表达载体转化拟南芥，获得的植株抗铝性提高，根伸长受铝抑制减弱。本发明找到了与植物受钼诱导的cDNA(称为^'卯基因)，将所述的基因转化到植物中可使植物抗铝性增加。利用本发明方法，可以显著提高植物的抗铝性，从而对植物生物量的增加特别是农作物增产有重要意义。图1显示的是来自谷子的&69cDNA序列，以及推导的氨基酸序列。图2显示的是含有5V砂cDNA的拟南芥表达载体构建过程图。图3显示的是T3代转基因拟南芥Western杂交。图4显示的是拟南芥根部苏木静染色图，其中左上图和右上图分别为野生型和转基因植株在20^MA1处理下的染色图，左下图和右下图分别是野生型和转基因植株在50|aMAl处理下的染色图(lOOpm标尺)；图5显示的是拟南芥根尖扫描电镜图(放大倍数上层xl.00K30pm标尺；下层:x2.50K12.0lim标尺)图6显示的转基因拟南芥和野生型的根尖伸长及MDA含量情况。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例l植物受铝诱导基因S/69的克隆选取谷子授粉后5、7及12天的未成熟种子，材料混合后，提取总RNA,磁珠法富集mRNA(Promega)，釆用Stratagene公司cDNASynthesisKit反转录合成cDNA,双链cDNA补平后，连接五"RIadapter,将其构建至人ZAPII载体上，使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(Stratagene公司)进行体外包装。包装完毕后，加入SM溶液和氯仿，离心后，上清即为构建好的文库。取lpl文库上清液进行滴度测定，结果表明构建的文库容量为2xl07pfo/ml。原始文库构建完成后，扩增一次备用。利用酵母双杂交(Clontech公司)筛选cDNA表达文库，技术为公知技术，经过筛选后，得到阳性克隆。进行序列测序,测序结果如SEQIDNo.1所示，称之为S/65>。实施例2植物受铝诱导基因&"的克隆1、植物组织总RNA的提取(1)将4ml苯酸与8mlRNA提取缓冲液混匀后，放在65°C水洛预热；(2)取谷子叶片约5g，加入液氮和少量石英砂，研钵中充分研磨成粉末，装入50ml离心管；(3)将预热的提取混合液加入含有植物材料粉末的离心管中，与植物材料充分混匀，室温抽提10min;再加入4ml氯仿，继续抽提10min;(4)室温条件下12,000rpm离心20min;吸取上清液，加入等体积氯仿再抽提一次；(5)室温条件下12,000rpm离心20min;吸取上清液，加入1/3体积的8mol/LLiCl，混匀后置于4。C放置16h或冰上放置8-12h，沉淀RNA;(6)在4。C条件下12,000rpm,离心20min,弃去上清液；(7)加入2ml70o/。乙醇洗涤RNA沉淀，室温条件下12,000rpm离心5min，将RNA沉淀在超净工作台内吹干，溶于适量DEPC处理水中，在-20°C(短期)或-70。C(长期)保存备用。2、RT-PCR(1)cDNA第一链的合成在经DEPC处理的离心管中依次加入以下成分试剂用量RNA5吗oligdT0.2吗DEPC-H20补足体积至20^混匀后瞬时离心，在70。C变性5min,冰上冷却。依次加入以下成分试剂用量5xRTbuffer10|alRNasin0.5^dNTP1niM-MLV1piDEPC-H2017.5piTotal50(xl混匀后瞬时离心，在42。C反应60min。(2)PCR反应反应体系如下反转录产物1-2^15'primer(100ng/jjl)1pi3'primer(100ng/|jl)l^ddNTP(lOmmol/Leach)1jallOxTaqBuffer5|alTaq(51%1)1WSDW补足终体积至50pi首先将上述试剂加于200jxl离心管，混匀，瞬时离心，放于PCR仪上。用于&砂cDNA全长扩增引物PI:5'-GCGAGGAGAGAGGAGGGAAGAGC隱3'P2:5'-CGTCTCAGCGGTTCAGCGGATA-3'。扩增条件如下94。C,变性1min;60。C，退火1min;72°C,延伸1min;扩增循环数35;最后72°C，延伸10min。取适量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物放于-2(TC保存。将PCR产物连接到T-vector,进行酶切和序列测序，鉴定正确，命名该质粒为pS,'69。实施例3用于拟南芥中表达S/69的表达载体的构建和转化农杆菌表达盒是由花椰菜花叶病毒"5*启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3转录终止区域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-570)组成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII)。如图2所示，以57卯质粒(实施例2的阳性克隆质粒)为模板，利用PCR扩增，使5，端带入SamHI酶切位点，3，端带入flag-tag标签(MDYKDDDDK)和酶切位点，使flag-tag与Si69融合。扩增引物PI(5'-CGGGATCCAAGCGAGGAGAGAGG-3')，P2(5'画GCGAGCTCTCAC7TGTCGTCGTCGTCCTr，GTCC^4CTGGTTGGACCAGT-3'),反应体系如下表所列，5769质粒5'primer(100ng/|il)1pl3'primer(100ng/(il)inidNTP(10籠ol/Leach)1pl10xTaqBuffer5^1Taq(5U/nl)1(alSDW补足终体积至50nl扩增条件为94°C,变性lmin;60°C,退火1min(退火温度及时间应根据引物的长度及Tm值来确定)；72°C，延伸1min;扩增循环数30-35;最后72°C,延伸10min。取适量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物放于-2(TC保存。克隆至pMD18-T，测序正确。将带有flag-tag标签的Si69用万"附HI和S"cl双酶切，回收840bp的片段；将双元表达载体pBIUl((购自Clontech公司)用5amHI和&cl双酶切，除去报告基因GUS,回收载体大片段，将载体和目的片段连接，转化后，得到构建在pBI121载体上，由35S启动子驱动的S柳cDNA.正向插入的重组质粒pBI121画Si69。将pBI121画Si69采用冻溶法直接转化农杆菌GV3101，获得含有重组质粒pBI121-Si69的农杆菌GV3101(pBI121-Si69)。农杆菌转化技术为公知技术。实施例435S启动子AS/69表达载体转化拟南芥野生型拟南芥植株生长约4周后，出现初级花序。初级花序长至5-10cm高时将其剪去，使其次级花序生长。6-7天后，植物次级花序即将开花，或仅有极少的花已开，此时是转化最佳时期。农杆菌转化拟南芥植株的方法采用花芽浸泡法[CloughSJandBentAFFloraldip:asimplifiedmethodfor^4gro6ac^n'ww-mediatedtransformationof」ra6Wo戸^PlantJ,1998,16:735-743)，将拟南芥植株倒置，使莲座叶以上的花序浸入稀释好的菌液约3min，期间轻微晃动。将菌液浸泡过的植株横放至22T:环境中，暗培养24小时后，竖直见光培养至收获种子。收获的T。代转基因植株的种子用70%酒精处理2min，0.5%次氯酸钠消毒处理8-10min，再用无菌水洗涤4-6遍。将种子均匀置于含Kan50|ig/mlMS培养基上筛选。置4。C暗培养2-3天进行春化，然后光照培养(16h光照，8h黑暗)7-12天，取抗性苗50株(苗深绿色，有真叶，有真正的根)移栽到花盆(花丼营养土蛭石=1:l)培养，获得Ti代转基因种子，有85%的转基因株系筛选得到3:1比例分离的阳性植株。同时用上述相同的方法转化不含Si69的空载体，作为阴性对照。提取阳性植株基因组DNA,扩增&'69基因。引物P1:5'-GCCAACCTGAAGCAGCACTA-3'和P2:5'-GCGTAAGGAACGTAGCAGAA-3',反应体系如表所列，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>扩增条件为94°C，变性lmin;55°C,退火1min(退火温度及时间应根据引物的长度及Tm值来确定)；72°C，延伸1min;扩增循环数30-35;最后72°C，延伸10min。取适量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度619bp。其余产物放于-2(TC保存。结果表明，被检10株阳性植株均扩增得到&仰基因，而野生植株(2株)和阴性对照(转化不含5V砂基因的空载体植株)均未检出。实施例5转基因拟南芥中蛋白的检测提取T3代转基因拟南芥叶片总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，恒流冰洛转膜后进行Westernblot杂交。其中一抗为anti-flagtag抗体，稀释比例为1:10,000，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，稀释比例为1:10,000。Western杂交结果参见图3。图中结果表明Si69在转基因拟南芥中稳定表达。实施例6转基因拟南芥中根部苏木静染色和扫描电镜观察实验对象阳性植株10株，每组5株；阴性对照4株，每组2株；野生型植株4株，每组2株。样品处理野生型、阴性植株和转基因拟南芥种子用70%酒精处理2min，0.5%次氯酸钠消毒处理8-10min，再用无菌水洗涤4-6遍。将种子均匀置于含50吗/mlKan的MS培养基上筛选。置4。C暗培养2-3天进行春化，然后22。C光照培养(16h光照，8h黑暗)7天，用含有不同铝浓度(20iiM和50laMAlCl3)的1/6MS(含10g/L蔗糖)培养液(pH4.0)分别处理植株根24h，根在铝处理后用200ml蒸馏水浸泡15分钟，然后用50ml苏木精水溶液(w^O.P/。苏木精w=0.01%KIO3O.lmmol/LNaOH)染色20分钟，最后用去离子水浸洗15分钟至无浮色。用显微镜观察根尖染色情况并拍照。取拟南芥幼苗，用5%戊二醛溶液固定，抽气至样品沉到固定液中，再用锇酸固定2小时，经乙醇系列脱水，C02临界点干燥，喷金属膜后用曰立S-570扫描电镜观察。显微镜观察结果显示在2(HlMAlCl3处理后转基因拟南芥根尖基本都没有染上红色，而野生型拟南芥和阴性对照根尖呈蓝紫色；50pMAl处理后，转基因拟南芥根尖有浅紫色出现，染色程度要明显低于野生型(深红色)(图4)。扫描电镜观察，结果显示20|iMAlCl3处理后，转基因拟南芥的根尖结构都没有变化，和野生型没有受铝处理的拟南芥根尖细胞结构基本相同；50^iMAlCl3处理后，转基因拟南芥根尖伸长区细胞出现部分凹陷，但破坏程度不严重，相比之下，野生型拟南芥和阴性对照在铝离子处理下根尖细胞受到严重破坏，特别是根冠和伸长区，细胞大量凹陷(图5)。实施例7转基因拟南芥根伸长和丙二醛含量测定实验对象阳性植株6株，每组3株；野生型植株2株，每组1株。野生型和转基因拟南芥种子灭菌春化处理后，将生长7天的幼苗转到分别含有20pM和50pMAlCl3的培养液中生长72小时。测量处理前后的根长，与正常生长情况下的根伸长对比，20和50iaMAlCl3处理后，野生型拟南芥根相对伸长分别减少35%和70%，而转基因拟南芥根相对伸长分别减少10-25%和50-55%。称取AlCl3处理过的拟南芥根部0.5g，加入lml10。/。TCA研磨至勻浆，加入lml0.6。/。TBA溶液，混匀物于95°。反应20分钟，迅速冷却后10000g离心5分钟，吸上清，测定532、600、450nm波长下的消光度。MDA浓度(nmol/L"6.45(A532-A6。o)-0.56A450MDA含量(iamol/g"MDA浓度(iimol/L)x提取液体积(ml)/植物组织鲜重(g)在2(HiM和50(iMAlCl3处理下，与对照相比，野生型拟南芥根部MDA含量分别增加3.5倍和5.0倍，而转基因拟南芥根部MDA含量分别是对照的2.0倍和3.5倍，要明显低于野生型(图6)。序列表说明SEQIDNo.l&2是Si69基因及其编码的氨基酸序列；SEQIDNo.3&4是用于扩增S/卯cDNA全长的引物序列；SEQIDNo.5&6是扩增质粒并在其两端引入酶切位点和标签的引物序列；SEQIDNo.7&8是用于检测S/69基因的引物。序列表〈110〉中国农业大学<120>利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法<130〉KHP09112101.5<160>8<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>765〈212>DNA<213〉谷子<220〉〈221〉CDS<222>(1)..(765)〈400〉1atgctggcggtgttcgatcccacggtggccaagtgcccggagggcetc48MetLeuAlaValPheAspProThrValAlaLysCysProGluGlyLeu151015cgcageccgctggtggccggcgcggccgetgccgcggccggcggcgtg96ArgSerProLeuValAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyGlyVal202530ggcgcgetcatgaagggcttctecgccteacacgacggcaccgtcacc144GlyAlaLeuMetLysGlyPheSerAlaSerHisA印GlyThrValThr354045gtcagectggggccctecggcgcgctggcgcacteggcggccaaccag192ValSerLeuGlyProSerGlyAlaLeuAlaHisSerAlaAlaAsnGin505560agecccetcgtccctaggttgtttggtgetgtgaatgacatettttgc240SerProLeuValProArgLeuPheGlyAlaValAsnAspliePheCys65707580ctgttccaagggaacattgagaacattgccaacctgaagcagcactac288LeuPheGinGlyAsnlieGluAsnlieAlaAsnLeuLysGinHisTyr859095ggcctgageaagacegccaacgaggtgactateetcategaggcctac336GlyLeuSerLysThrAlaAsnGluValThrlieLeulieGluAlaTyr100105110agaaccctgagggacaggggtcccgtccca_gccagecaggttgtgaga384ArgThrLeuArgAspArgGlyProValProAlaSerGinValValArg115120125gatcttagtggaaagttcgcattcatettgtatgacaccctgtegaag432AspLeuSerGlyLysPheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140tecaccttcgttgetgetgacgetgatggcageatecccttcttctgg480SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160ggcgtcgacteggaggaccacetcgtgttctctgacgatgetgggeta528GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175etcaagaccggctgcggcaactegttcgcgccattccctaaaggttgc576LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190ttctacaccacctecggcgggctgcagagetacgagcacccgctgcac624PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205gaggtc卿gcggtgccgcgcgtggscagecagggccsg3tgtgcggc672GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220tecaccttcaaggtcgacagegagaccaagaagaagcaggacgccage720<image>imageseeoriginaldocumentpage16</image>PheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220SerThrPheLysValAspSerGluThrLysLysLysGinAspAlaSer225230235240lieProArgValGlySerAlaAlaAspTrpSerAsnGinPhe245250<210〉3<211>23<212〉DNA<213>人工序列<400〉3gcgagg卿gaggagggaagage23<210>4〈211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400>4cgtctcagcggttcagcggata22<210>5<211>23〈212>DNA<213>人工序列<400>5cgggatccaagcgaggagagagg23〈210>6<211〉52<212>腿<213>人工序列<400>6gcgagctctcacttgtcgtcgtcgtccttatagtcgaactggttggaccagt52<210>7<211>20〈212〉醒<213>人工序列<400>7gccaacctgaagcagcacta20<210>8<211>20〈212>DNA<213>人工序列<400>8gcgt犯ggaacgtagc卿a2018权利要求1、Si69基因在增加植物抗铝性中的应用。2、一种利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法，其特征在于，所述的基因为&砂。3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法使用含有5V砂基因的表达载体转化目的植物。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达载体的启动子为组成型启动子。5、如权利要求24任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为双子叶植物。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。7、如权利要求24任一项所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pBI121-Si69。全文摘要本发明提供了一种利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法，该方法利用Si69基因来提高植物的抗铝性。研究表明，通过将Si69基因转化植株，能够显著提高植株的抗铝性。本发明方法对植物生物量的增加特别是农作物增产有重要意义。文档编号A01H5/00GK101532029SQ20091008034公开日2009年9月16日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者于静娟,敖光明,倩赵,赵琳娜申请人:中国农业大学