专利名称：：一种花药绒毡层和花粉特异性高效启动子及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体地说，涉及一种从玉米中分离到的花药绒毡层和花粉特异性高效启动子序列及其应用。从玉米基因组DNA中克隆得到的上述花药绒毡层和花粉特异性启动子，并与不同的同源、异源基因连接构建植物表达载体，转化宿主植物，使转基因植株划分高效特异表达其下游基因的方法和应用。
背景技术：
：转基因植物研究与开发的过程中发现，外源基因表达的时间，空间和表达量，往往是造成无法得到理想的转基因植物和有效的研究基因作用机理的重要因素。转录水平的调控是植物基因表达调控的最重要的调控方式在。启动子的驱动活性和特性直接决定了基因表达的时空特性以及表达量的多少。因此，对植物启动子的克隆和功能分析非常重要。杂种优势作为一种提高作物产量，改善作物品质，提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛的应用，并取得令人瞩目的成就，以植物雄性不育为基础的杂种优势利用已成为许多作物的育种目标，在农业生产上发挥巨大的作用。但自然出现的雄性不育类型很少存在着周期长，不育基因来源单一等问题，而且恢复系的培育和后代的筛选上也存在着一定的不足。而利用基因工程创造雄性不育的策略为杂种优势的利用克服了上述缺陷。主要利用花粉或花药特异表达启动子，驱动目标基因在花粉中特异表达，获得雄性不育植株。例如Mariani等利用烟草花药绒毡层特异启动子TA29将核糖核酸基因导入烟草，结果核糖核酸酶特异表达能够选择性地破坏与花粉发育相关的一些器官或组织，阻断花粉发育进程，导致植物雄性不育[MarianiC,BeuckeleerMD，TmettnerJ，LeemansJandRobertBG..Inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene.Nature1990.347:737-741]。Paul等[PaulW,HodgeR，SmarttS,Draper,JandScoottR.Theisolationandcharacterizationofthetapetum-specificv4raZ)z'cfo/w7JA9gene.PlantMol.Biol.1992.19:61l-622]利用拟南芥花药绒站层特异性启动子A9特异表达核糖核酸酶基因同样获得了雄性不育烟草植株。Hird等将与抗病性相关的P-l，3葡聚糖酶基因分别与拟南芥花粉发育早期启动子A9，A3融合，转化矮牵牛后获得不同程度的雄性不育植株[Hird,D丄.，Worrall,W.,Hodge，R.,Smartt,S.,Paul,W.，Scott,R..Theanther-specificproteinencodedbytheBraM/ca"a/船andy4ra6zVio戸'sZ/za//a"aA6genedisplayssimilaritytobeta1,3-glucanases.PlantJ.1993.4:1023-1033]。目前对花药特异基因的转录调控还知之甚少，花药特异启动子的获得有助于深入理解花药和花粉发育。玉米中已经获得的花药特异基因有10余个，大多数是花粉特异，同时在花粉和花药中表达的基因很少。
发明内容本发明目的之一是提供一种花药绒毡层和花粉特异表达启动子序列，来自于玉米基因组DNA，在植物花药绒毡层和花粉中特异表达。本发明的另一目的是提供一种驱动同、异源基因在花药绒毡层和花粉中高效特异表达的新方法。本发明通过利用花药特异的cDNA片段，筛选玉米基因组文库，得到的核苷酸序列，称之为pZmW7，长度为1971bp,为双链核酸类型，其序列如序列表SEQIDNo.l所示。通过三大数据库的检索，未发现有相同或相似性较高的序列。生物信息学分析pZm^7序列，发现其具备真核启动子的基本元件(TATAbox和CAATbox)和花药特异表达的相关顺式元件(GCbox，NTP303Qelement,LAT52Qelement)。本发明还提供了含有上述启动子的重组表达载体。所述启动子的下游可连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA,用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。所述重组表达载体为植物重组表达载体。在一个优选的实施方式中，其表达盒是由/Zm4W启动子和GUS(卩-葡糖醛酸酶基因)报告基因及来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII),所述的表达载体优选的是重组质粒pZm401::GUS。本发明将上述含有所述；Zm4W启动子序列的重组表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，获得外源基因在花药绒毡层和花粉中高效驱动表达的基因工程化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞。在一个优选的实施方式中，将含有所述pZm4W启动子序列驱动的表达载体转化烟草，获得了GUS基因在花药和绒毡层中高效驱动表达的转基因植物。本发明所述的植物宿主细胞或宿主组织可以是植物花药绒毡层和花粉细胞或植物药绒毡层和花粉细胞本身，或它们的后代，蛋白质等组成成分或花药和绒毡层特性已经改变的植物花药和绒毡层细胞或植物花药和绒毡层本身。本发明所述的植物组织中表达花药和绒毡层特异性启动子的方法，包括下述步骤(1)将含有本发明启动子的植物表达载体导入植物细胞；(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。本发明中所述的核酸序列还可以是还可以是所述核苷酸序列与其他启动子融合序列。本发明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其他活性物质功能，包括RNA或DNA序列，该序列与种子特异性启动子正常情况不相结合。此核酸序列包括不同于启动子植物种类的异源核酸序列，以及从相同于启动子植物种类得到的同源核酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种载体，如pBI121等。本发明中所述的转化技术是指已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法等。本发明中所述的宿主细胞或宿主组织及后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整株植株(包括种子)。术语"核酸序列"指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷酸单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分被修饰或取代的序列。术语"花药绒毡层和花粉特异性启动子"是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的植物花药的绒毡层和花粉中优先表达。本发明找到了玉米花药绒毡层和花粉特异高效表达启动子序列，并对这一启动子的花药绒毡层和花粉高效特异活性进行了功能验证。将所述的启动子序列连接异源或同源基因后，转化到植物中可使异源或同源基因在植物花药绒毡层和花粉中高效特异表达，避免了目的基因在其他部位持续表达所带的不利影响。本发明提供了一种利用所述核苷酸序列驱动目的基因在植物花药绒毡层和花粉中高效特异表达的新方法，在植物的遗传改良，雄性不育的创造和转基因生物安全性研究方面具有重大的应用前景。图1显示的是来源于玉米的花药绒毡层和花粉特异表达启动子序列pZm4W的相关启动子元件。图2显示的是由/7Zm4W驱动的植物表达载体的构建过程。图3显示的是植物表达载体Zm401::GUS的酶切和PCR鉴定图，其中泳道1~4依次为Sacl，i^I+Jftal，五coRI,Wal的酶切电泳，6为PCR产物(1535f/r),5&7为X/历"din+五coRI。图4显示的是不同时期的再生烟草，其中A&B抗性芽形成，C、D&E烟草植株再生，F转化烟草植株开花。图5显示的是部分转基因烟草植株的PCR检测结果，A:Zm^W启动子的PCR检测，B:g^基因的PCR检测，2&17:阳性对照，3&16:阴性对照(wildtype),1&18:X/历mffll+五coRI,其他为不同转化植株。图6显示的是部分转启动子报告基因融合载体转基因烟草的Southern杂交检测，其中1-5:不同转化植株杨蓓，6:野生型，7:质粒对照，8:入編dlII+五coRI。图7显示的是Zm401::GUS转基因烟草根、茎、叶、花药和花粉的组织化学分析，其中A:根；B:茎；C:叶；D:转基因花药的GUS染色；E:成熟花粉的GUS染色，放大倍数40x,标尺30pm。图8显示的是Zm401::GUS转基因烟草花药的GUS组织化学分析，其中A:转基因花药截面，B:野生型对照截面.放大倍数200x,标尺=50具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1.玉米花药绒毡层和花粉特异性启动子序列/iZ附4W的克隆以从玉米成熟花粉cDNA文库中分离得到了花粉特异性表达的cDNA克隆Zm柳(682bp)(Lietal.，2001)为探针(其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示)筛选玉米基因组文库(Cat.#FL1032D,Lot#5443,Clontech,PaloAlto,CA,USA)，得到了Zm卯7基因的基因组克隆pGZM401。序列分析该基因组DNA全长6.0kb，其中5，端1-2000(序列起始处碱基定位l)为推断的启动子区段，该区段具有RNA聚合酶II结合的顺式作用元件TATAbox(1844-1849)和CAATbox(1720-1723)，此外还有花粉特异表达的顺式元件GCbox(1496-1500)，能够调节基因表达量的6bpQ因子(NTP303Qelement,AAATGA,No.801-806和LAT52Qelement,TGGTTA，No.1266-1271)(图1)。实施例2.玉米花药绒毡层和花粉特异性启动子序列/;Zm^W的分离设计并合成如下两条引物，为以后分离和构建的需要，在两个引物的5'端分别加入了限制性内切酶//z'"din位点和限制性内切酶力"I位点引物1:5，CCA4GCTrCTGCAGACATAGCTCTCGAC3'引物2:5，CATCAAACACTTGGCCTATTACTAGCC3'以质粒DNApGZM401为模板，进行PCR反应，反应体系如下反应组分加入量缓冲液(10X)(含20mmol/LMgCl2)2，dNTP(1Ommol/L)引物1(lOpmol/L)0.5^il引物2(10pmol/L)0.5^1Taq(2.5u/|il)0.5)xlH2019.5^1模板质粒(0.2吗/jil)0，总体积25%1扩增条件95。C10min;95。Clmin、58。Clmin、72。C2min,共30个循环；72。C10min,扩增得到1971bp的DNA片段(如SEQIDNo.l所示)。用DNA胶回收试剂盒(天为时代生物公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEN-3zf(+)(Promega)中，连接产物转化到用CaCb法处理的大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨节青霉素(终浓度100吗/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨节青霉素(终浓度100昭/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，etal.，1989,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,p19-21]提取质粒，经限制性内切酶历"am和范ai双辦切和PCR扩增鉴定阳性克隆，命名重组质粒为p401pro3Z。实施例3.植物表达载体pZm401::GUS的构建如附图2所示，用碱裂解法提取p401pro3Z质粒，经过5^/I酶切，Klenow补平，再用^YZ^I酶切，得到/ZwW/启动子片段，与经过/f/"d111酶切，Klenow补平，再用酶切的植物表达载体pBI121(ClonTech)的大片段相连，然后将连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5ot感受态细胞中，在含有卡那霉素(终浓度100吗/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度10(Vg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经限制性内切酶酶切和PCR鉴定正确(图3)。实施例4.pZm401::GUS表达载体转化烟草利用冻融发将重组的植物表达载体pZm401::GUS转入根癌农杆菌LBA4404,转化方法参照Hofen等[HofenR，WillmitzerL，Storageofcompetentcellsfor^gro6ac&r/wmtransformation.I^ucleicAcidsResearch,1988.16,9877]。烟草的转化参照Horsch等[HorschRB,FryJE，HoffmanN.Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants.Science,1985.227:1229-1231]。转化受体为烟草(Mco"a"ato6acwwcvSamsun)。将过夜培养的农杆菌LBA4404(含有pZm401::GUS)菌液，按照1:100比例转接至YEB液体培养基中，振荡培养至OD綱值约0.6—0.8左右；收集菌体后，用渗入缓冲液悬浮菌体，稀释到OD6QQ值约为0.6左右，先将无菌的烟草叶盘与转入pZm401::GUS质粒的农杆菌共同孵育。十分钟后，将叶盘转移到MS基本培养基黑暗条件下共培养3d。然后将叶片转移至MS分化培养基(3mg.r16-BA,0.2mgT1NAA，100mg.r1Kan，500mg.r1Cb)培养(光周期16h/8h),约四周后将抗性再生苗从外植体上切下，转到MS生根培养基(100mg'r1Kan,500mg.r1Cb)诱导生根(光周期16h/8h)，约两周后即可生出细嫩的抗性根。将生根良好的再生植株转移到温室中，经练苗后移栽到小花盆中(营养土:跖石=1:1)(附图4)。实施例5.转基因烟草的分子检测PCR检测使用植物基因组DNA少量提取方法提取再生烟草植株叶片DNA,利用Zm^W启动子内部引物和g^引物进行PCR扩增。结果表明，携带有外源基因的转基因烟草可以扩增出与转化质粒扩增产物大小一9致的目的条带，而未转化植株则没有相应大小的产物(图5)。Southern杂交检测对于PCR检测结果为阳性的植株，进行基因组Southern杂交检测。取30吗烟草基因组DNA,并用限制性内切酶州'miIII彻底酶切，以[a-"P]标记的2.0kb的，+腿片段(2.0kb)作为探针，进行Southern杂交。杂交结果表明，目标片段以不同位点整合入烟草基因组中(图6)。实施例6转基因烟草的GUS活性的组织化学检测GUS基因活性的组织化学染色分析方法依据Bradford等人[BradfordHM.Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[J].AnalBiochem.,1976,72:248-254.]。将收集转基因烟草的不同组织材料与含底物X-Gluc(X-Gluc染液组成1.0mg/|ilX-Gluc;50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0;10mmoi/LEDTA,pH8.0;0.05mmol/L铁氰化钾；0.05mmol/L亚铁氰化钾；甲醇，终浓度20%;0.1%TritonX-100.)的染色反应液于37°C保温6-8h，进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用95%乙醇脱色后观察。结果发现，与对照株相比，转基因烟草的根、茎、叶均未有蓝色出现，仅有转基因烟草的花药和成熟花粉有蓝色出现，如附图7。将GUS染色后的转基因烟草花药经抽气后固定在FAA固定液中，制备石蜡切片(厚度10imi),在光镜下进行观察。结果表明ZmW/启动子可以驱动报告基因在花粉，绒毡层和药隔组织中表达。另外在药室内壁也有微弱表达。野生型烟草的花药中未观察到报告基因的表达(附图8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>agagtacctctgtcaggtaccaaactttgggttttaaaggataaagacgagaccgggcgg1500gtgccttgcacgagaaggaagtctcggtgtagtgtctccgtctgagtcgtttaaggatcg1560agccgatgtaggcttgatgatcaaggaccttttaactggccacatgcctcatcatgtgta1620agctttgcctcgatcggacccaatactaga肌agctaccacgcaatgggagtgg,gat1680ggCg卿gt3gC3t3t3CCCtccgtggcaactatgccctc1740ggttggcgtgaacccattctagtcttgaga肌tccgggtgtgagttgacatatgc犯gg31800catatgttgtgtggttggsgatccccagctgggtatt犯tcaattcgaat1860cgatgttacttctcaaacatg卿acttggtcactgacctacacgtagcaacaagtg犯c1920gctsgtaataggccaagtgtttgatctagat1971<210〉2<211〉633〈212〉DNA〈213〉ZeamaysL<400〉2cgttgctgtcggstgtgg肌tcgtagacccgagggatatgaacggacttgtggettggctg60accacggcgcgatgtctcacggtggtgttcttggccgatt120gagctatggtggat肌tcgggagcgaggagtggtgctctgggtgcgtaaca卿aggcgg180ggcgtcaatttatagggattgsccactggtgctacgaatttgggca卿t240tg3gCtt3CggCggtg3gtgggtgagtcaccggagtatggCt3CCgtggt300gcaaggtctcgggtggt犯ctggctatcactcacgactcattgtgacgtg360cgatggtgtggcgcgaccgaggt肌acggcggccaccatggcgacggtcgcacggccacg420gcgccgggcaagtgggtacgacgaggc卿cccaatcca^cccccttctgatcttttcac480tcctgcggtaatatccttcctgaaxxaagcacg犯tcacagcggccagcgcgaatcctca540tgcggagattaccgacgagctcatttaccagcctgacagagcaatttgaggagctttgtt600cttcggttttcatgtgacgaeiccgeicagcaacg633<210〉3〈211>28〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉3cc肌gcttctgcagacatagctctcgac28<210〉4<211>27〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉4catcaaacacttggcctattactagcc271权利要求1、一种花粉和花药绒毡层特异性启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2、含有权利要求1所述启动子的表达载体。3、含有权利要求2所述表达载体的植物宿主细胞或植物宿主组织。4、如权利要求3所述的植物宿主细胞或植物宿主组织，其特征在于所述植物宿主细胞为植物花药绒毡层细胞或花粉细胞，所述植物宿主组织为植物花药绒毡层或花粉本身。5、权利要求l所述启动子或权利要求2所述表达载体在制备转基因植物中的应用。6、如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的植物为双子叶植物或单子叶植物。7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。8、如权利要求5所述的应用，其特征在于，用权利要求l所述启动子或权利要求2所述表达载体改造花粉育性。9、权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达载体在改造植物安全性中的应用。全文摘要本发明提供了花粉和花药绒毡层特异性启动子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。该启动子序列是通过对玉米基因组文库筛选，从玉米基因组中克隆得到的，其能驱动目的基因在花药绒毡层和花粉中具有特异性表达。本发明包括利用该启动子序列来创造雄性不育的植物基因工程方法，更具体的说，将所述启动子下游衔接异源或同源基因，并构建植物表达载体，转化宿主植物，该启动子序列能够驱动其下游基因在其花药绒毡层和花粉中高效特异表达目的蛋白，实现创造植物雄性不育，或者改造转基因植物的安全性。文档编号A01H5/00GK101532015SQ20091008035公开日2009年9月16日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者于静娟,刘俊起,敖光明,李成霞,王冬雪,倩赵申请人:中国农业大学