专利名称：增强型液体微生物有机肥料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种液体肥料的制备方法。具体是以牛粪、鸡粪以及水稻秸杆的混合 物制作堆肥，再以此堆肥产物为原料，并接种可以在植物体内定殖且对植物病原菌有生长 抑制作用的微生物，通过二次液体发酵制备一种对农作物有防病促生长作用的液体肥料， 属于农业废弃物综合利用领域。
背景技术：
据统计，我国每年农业废弃物产生量约达38亿吨，其中动物排泄物有17. 5亿吨， 农作物秸杆6. 5亿吨，其他废弃物5亿吨.而且这些废弃物每年以5-8%的速度在继续增 加。对这些废弃物的利用方式，目前主要是通过堆肥技术生产固体有机肥。堆肥处理是固体废弃物(动物排泄物、城市及乡镇垃圾、污泥、农作物秸秆、农产 品加工废气物等)减量化、无害化以及资源化最有效的处理方法之一。堆肥原料成分复杂， 彼此互补性好，生物堆肥过程中会产生各种中间代谢产物及各种营养类型的微生物群落， 因此，堆肥产物可能是继土壤之后的又一个微生物资源库。近几年，高效设施农业正以前所未有的速度和规模在我国迅猛发展，长期的重茬 和“三高”(高温、高肥、高湿)使得土壤质量严重恶化，连作障碍/ 土传病害日趋加重，常规 的物理、化学防治效果不断降低，且化学防治也因环境污染和食品安全问题不断得到限制。 因此，亟待寻找安全、高效克服和防治连作障碍/ 土传病害的途径。国外研究表明，以废弃 物堆肥产物为原料通过二次发酵制备的液体微生物肥料液具有“药肥”合一的功效，能显著 降低进某些病害的发生率，进而可以发展成一种替代化学农药防治某些植物病害的有效手 段。有机肥以固体形式直接施入操作简单，因而在生产中被广泛应用，但缺点是只能 根施，因此在施用方式和充分发挥功效方面受到很大限制，而以堆肥产物为原料，通过液体 好氧发酵制备出集有机、无机营养物质及优势微生物种群及其代谢产物于一体的液体肥料 (以下称液肥)，既可根部施入也可液面喷施，既能提供作物生长所需的营养成分又通过其 中的微生物及微生物的代谢产物抑制植物病害的发生，起到“药肥”双效化的作用。不但实 现废弃物资源化高效利用，而且对于农药化肥的减量化施用、保护环境和食品安全生产具 有重大的理论与实践意义，为连作障碍/ 土传病害的防治提供新思路、挖掘新的技术途径。关于用堆肥产物生产液体肥料，国外的研究利用始于上世纪60年代，目前已经形 成了成熟的产品制备和应用推广技术，广泛应用于水果、蔬菜、花卉等经济作物，具有显著 的增产和防病作用，从而减少化肥、农药的用量。液肥的肥效是由有机肥、有益微生物以及 微生物与有机肥的交互作用产生的，除有“肥效“外，还具有“药效”，即其中所含的多种有 益微生物及其代谢产物能抑制许多病原菌的生长、繁殖，对多种植物病害具有防治效果。 Weltzien试验了 32种不同原料堆肥制备的液体肥料对灰霉病分生孢子萌发的抑制效果， 发现使用动物排泄物堆肥制作的液肥的抑病效果好于植物残体堆肥液肥。Scheuerell and Mahaffee试验了来源于庭园碎屑、鸡厩肥以及木屑制作的液体肥料对玫瑰粉霉病抑制效
3果，结果鸡厩肥液体肥料效果最好。Ketterer在马厩肥中添加1 %的麦乳精发酵，提高了液 体肥料对霉菌的抑制效果；Urban and Tranker通过添加5_7克/升蛋白胨或酵母提取物， 使液体肥料对灰霉菌的抑制效果达100%。以堆肥产物为原料制备的液肥是一个复杂的有机、无机营养和微生物的混合群 体，因而，其对农作物的功效可理解为多效叠加和选择性作用的结果。肥效已被大家广泛接 受，关于药效，即液肥的防病机理，主要有1、液肥对病原菌的直接抑制作用，2、液肥中的微 生物对病原菌的拮抗作用，3、液肥对植物的肥效作用增强了植株的抗病生理活性及形态抗 病性经液肥处理的植株，叶绿素含量和过氧化氢酶活性均比对照明显增高，致使植株抗病 性增强，4、液肥诱导植物的抗病性，液肥作为一种抗性诱导因子，在诱导植物抗性方面起了 积极作用。与常规微生物相比，内生菌由于能进入植株体内，与植物形成共生体系，因而其生 存环境相对稳定、受外界环境影响较小，具有明显的生存优势，而且通过与植株互作可有多 种促生、防病机理，效果更加显著稳定。液肥成分的复杂性决定了其功效的多变性和不可预见性，具体表现就是同一种液 肥不仅对不同作物的促生防病效果不同，对同一作物的效果也不稳定。究其原因发现堆肥 原料种类及液肥的制备方法是关键的影响因子。因此，如何以某种指定的堆肥产品为原料，通过控制发酵工艺或添加功能明确的 增强因子，制备靶标明确、促生防病效果稳定的液肥产品，或者如何针对具体的靶标作物或 病害，选择适宜的堆肥产品、制备效果稳定的液肥产品，必将成为研究者和生产实际关注的执占。而我国在这方面的研究几乎处于空白。仅有的几篇报道是直接利用畜禽粪便或其 他农业废弃物与水混合进行厌氧怄制或者以腐熟的粪便与水混合直接进行厌氧或好氧发 酵获得液体肥料，未有利用腐熟堆肥进行液体间歇好氧发酵并同时添加功能明确微生物的 相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前以堆肥产物制备的液体肥料功效不稳定和不明确的 问题，提供一种通过接种功能明确的微生物进行间歇好氧发酵，制备液体微生物有机肥料 的方法。本发明的目的是这样实现的一种增强型液体微生物有机肥料的制备方法，以腐 熟的堆肥产物为原料，其特征在于在敞口桶状容器中，将腐熟的堆肥产物与水以1 8 10的体积比混合，接种具有防病促生作用的微生物菌剂，接种量为1 X 106cfu/毫升，在室温 20 25°C的间歇好氧环境发酵5 7天，再用100目筛过滤后，获得液体微生物有机肥料。在本发明的制备方法中，所述的防病促生作用的微生物菌剂为内生枯草芽孢杆菌 纯培养后所获得的粉剂。在本发明的制备方法中，所述内生枯草芽孢杆菌纯培养是指将内生枯草芽孢细 菌置入试管斜面培养基中进行试管斜面活化后，再置入装有液体培养基的容量为250ml的 三角瓶，装液量为80ml/250ml ；将三角瓶置于摇床培养3 4天，摇床的转速160r/min，培 养期的环境温度为28士2°C ；结束后以体积重量比为5%接种量接入固体培养基在28士2°C环境中继续培养6 8天，每隔2 3天翻拌一次，至产芽孢；最后自然风干或30°C烘干， 获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为lO^cfu/g。在本发明的制备方法中，将所述的固体菌剂粉碎后过20 40目筛，获得内生枯草 芽孢杆菌粉剂。在本发明的制备方法中，所述的试管斜面培养基为牛肉膏0.3克，蛋白胨1.0克， 氯化钠0. 5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7. 4 7. 6，琼脂15 20克；所述的液体培 养基为牛肉膏0. 3克，蛋白胨1.0克，氯化钠0. 5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7. 4 7. 6;所述的固体培养基为麸皮、草炭按照质量配比2 1配制。在本发明的制备方法中，所述的水为地下水或至少放置12小时的自来水；所述的 间歇好氧环境是指环境中强制通气与静置等时段交替，即间歇12小时，通气期间溶氧量 为 2 6mg/L。在本发明的制备方法中，所述的腐熟的堆肥产物是以牛粪、鸡粪和稻秸杆为原料， 腐熟的堆肥产物是这样获得的将牛粪、鸡粪和稻秸杆以1 1 0.2的干物质量比例混 合，调节碳氮比=25 30 1，水分含量调节到60 65%，进行堆肥，堆子高度80 100 厘米；当温度逐渐上升到60 65°C持续2 3天时开始翻堆，以后每隔2 3天翻堆一次， 当温度由高温逐渐回落到40 45°C时即可结束发酵，将堆肥产物自然堆放25 30天进行 后熟，后熟产物即为腐熟的堆肥产物。在本发明的制备方法中，堆肥中使用的农作物秸秆的长度为5 6厘米；当粪便 的水分含量高于70%，则用自然晒干的水稻秸秆掺入粪便水中调节水分含量，使其调节至 60 65%后再按上述步骤堆肥；堆肥原料的碳氮比可以通过尿素调节。本发明的优点在于本发明以大量廉价易得的牛、鸡粪便及水稻秸秆的腐熟堆肥 产物为原料，获得的液体肥料除了含有多种作物生长所必须的速效、缓效碳、氮、磷、钾元素 及其他矿物元素，还含有大量能降解纤维素、木质素的有益好氧微生物以及这些有益好氧 微生物的代谢产物；由于在液体发酵过程中接种了具有防病、促生作用且能在植株体内定 殖的枯草芽孢细菌，制备的液体肥料功能更加明确，靶标性更强，效果更加稳定；整个发酵 过程设备、工艺简单，易于操作；液肥中含有的大量有机、无机营养物质及多种微生物能，施 用后能显著改良土壤质量、平衡土壤养分及丰富土壤微生物的种群结构，发挥对作物促生、 防病的效果，从而减少化肥、农药的使用量，从而为资源循环利用、环境保护及农产品的安 全生产开辟新的思路。
具体实施例方式实施例1内生枯草芽孢杆菌菌株的获得及菌株特性本专利所述的内生枯草芽孢细菌由江苏省农业科学院农业资源与环境研究所从 大棚种植的辣椒植株体内、采用内生菌分离筛选的方法获得。该菌在液体培养状态下能分 泌多种抗菌物质，如抗菌蛋白、小分子抗生素等；而且分泌的小分子抗生素经120°C处理30 分钟仍然有生物活性，具有有极好的温度稳定性。该细菌对生产常见的枯萎病菌、疫霉病 菌、立枯病菌、黄萎病菌、菌核病菌、灰霉病菌等十多种病原真菌和青枯病菌、溃疡病菌、根 肿病菌等病原细菌有强烈的生长抑制作用，为广谱拮抗细菌；。宿主定殖实验显示该菌株可以在辣椒、黄瓜、番茄、西瓜等多种作物体内定殖，可以用在多种大宗蔬菜作物上。用该细菌制备的菌剂对辣椒、黄瓜、番茄或西瓜种子进行拌种后育苗，该菌即可通 过种子萌发过程进入植株体内，并在根、茎、叶内定殖；或者在上述植株移栽时，将该细菌菌 剂用水稀释100 200倍后对植株进行浸根或灌根处理，该细菌可以通过根部进入植株的 茎和叶。该菌株于2009年3月2日由江苏省农业科学院农业资源与环境研究所提供，保藏 于中国微生物保藏委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC7. 17 (非专利程序的生物材料 保存)实施例2枯草芽孢杆菌培养基的配制枯草芽孢细菌试管斜面培养基的配制称取牛肉膏0. 3克，蛋白胨1. 0克，氯化钠 0. 5克，溶解在1000毫升水中，调节pH 7. 4 7. 6，加入琼脂15-20克，加热煮沸至琼脂溶 化，补足体积至1000毫升，适当冷却后分装到试管中，装量为试管高度的1/5 1/6，用试管 塞塞好试管口，121°C高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用，斜面高度不超过试管 高度的1/3。液体培养基的配制牛肉膏0. 3克，蛋白胨1. 0，氯化钠0. 5克，溶解在1000毫升 水中，调节pH 7. 4 7. 6，溶解在1000毫升水中，调节pH 7. 4 7. 6，然后分装，装液量为 80 100ml/250ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121°C高压灭菌25min，冷却后备用。固体培养基的配制称取麸皮、草炭，它们的质量配比为2 1。在本实施例中， 取麸皮2kg，草炭1kg均勻搅拌，加水调整培养基水分含量为60 65 %，121°C高压灭菌 40min,第二天在同样条件重新灭菌一次，冷却后备用。实施例3 内生枯草芽孢杆菌粉剂的制备将实施例1的内生枯草芽孢杆菌的保藏菌种置入试管斜面培养基中进行试管斜 面活化后，再置入装有液体培养基的容量为250ml的三角瓶，装液量为80ml/250ml ；将三角 瓶置于摇床培养3-4天，摇床的转速160r/min，培养期的环境温度为28士2°C;结束后以5% 接种量(V/W)接入固体培养基在28 士 2°C环境中继续培养6 8天，每隔2 3天翻拌一次， 至产芽孢；最后自然风干或30°C烘干，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为lO&ncfu/g。 将该固体菌剂粉碎过20 40目筛后，获得内生枯草芽孢杆菌粉剂。实施例4腐熟堆肥的制备方法牛粪取自南京山田奶牛场，鸡粪取自南京象山鸡场。将牛粪、鸡粪和稻秸杆以1 1 0.2的比例(干物质)均勻混合，并将水分含量 调节到60 65%，碳氮比调节到25 30 1，进行堆肥，堆子高度80 100厘米；当温度 逐渐上升到60 65°C并持续2 3天时开始翻堆，以后每隔2 3天翻堆一次，当温度由 高温逐渐回落到40 45°C时即可结束发酵；将堆肥产物自然堆放25 30天进行后熟，后 熟产物即为腐熟的堆肥产物。堆肥中使用的农作物秸秆的长度为5 6厘米；粪便中的碳氮比可以通过尿素调 节。
实施例5增强型液体微生物有机肥料(简称液体肥)的制备方法在50升塑料桶中，将4公斤堆肥产物(实施例4提供)与40公斤自来水(使用 前至少放置12小时)均勻混合，加入4克内生枯草芽孢杆菌粉剂(实施例3提供)，在室温 (20 25°C )下间歇通气12小时(即在24小时内，连续通气12小时，再静置12小时)，通 气期间控制溶氧量为4mg/L，发酵6天，过100目筛过滤即获得目标液体肥料。实施例6液体肥(实施例5提供，下同)对草莓两种病原菌的平板生长抑制作用。试验方法采用平板菌丝生长抑制法分别将1ml各种液肥与溶化的50-60°C的 PDA培养基混合倒平板，凝固后在平板中央接种1个直径为4mm的病原菌菌丝块，28°C培养， 72h后测量立枯丝核病菌的菌落直径，120h小时后测量枯萎病菌的菌落直径，每处理5个重
复o试验结果如表1。由表1可见，液体肥对草莓两种植物病原真菌有不同程度的抑制 生长效果，平均抑制率在69-78%之间。表1 液体肥对草莓两种植物病原真菌的抑制 实施例7液体肥的土壤浇施使用液体肥对种子进行浸种处理后播种，以后每隔15 20天定期浇灌，有效防治苗期 土传病害，而且显著提高发芽率和齐苗率。以黄瓜为例育苗期间使用将黄瓜种子浸泡在液体肥中30分钟，捞出自然晾干后播种，出苗 后每隔15 20天定期浇施，用量为500公斤/亩，可以使黄瓜猝倒病发病率降低80 90 %，且明显提高黄瓜苗的整齐度。移栽时或追肥使用在黄瓜移栽时，每穴，浇施200 400毫升液体肥，缓苗后每隔 15 20天，再与浇水相结合进行土壤冲施，用量为400 600公斤，能使黄瓜枯萎病的发病 率降低70 85%，且增产10 15%。实施例8液体肥的叶面喷施使用以草莓为例将该液体肥料用水稀释1 2倍后(根据植株幼嫩程度)，用喷雾器 进行叶面喷施，每亩每次用量50 100公斤，整个生育期喷施3 4次，可以明显降低草莓 白粉病和霜霉病的发病率，且使得草莓畸形果降低20%，草莓品质显著改善，VC含量增加15 25%，固形物含量提高8 18%。 以番茄为例将该液体肥料用水稀释1 2倍后(根据植株幼嫩程度)，用喷雾器 进行叶面喷施，每亩每次用量80 100公斤，整个生育期喷施3 4次，可以明显降低番茄 病毒病和灰霉病的发病率，产量增加10 15%，且使得番茄畸形果降低10 20%，番茄品 质显著改善，固形物含量提高10 14%。
权利要求
一种增强型液体微生物有机肥料的制备方法，以腐熟的堆肥产物为原料，其特征在于在敞口桶状容器中，将腐熟的堆肥产物与水以1∶8～10的体积比混合，接种具有防病促生作用的微生物菌剂，接种量为1×106cfu/毫升，在室温20～25℃的间歇好氧环境发酵5～7天，再用100目筛过滤后，获得液体微生物有机肥料。
2.根据权利要求1所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于所述 的防病促生作用的微生物菌剂为内生枯草芽孢杆菌纯培养后所获得的内生枯草芽孢杆菌 粉剂。
3.根据权利要求2所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于所述 内生枯草芽孢杆菌纯培养是指将内生枯草芽孢细菌置入试管斜面培养基中进行试管斜面 活化后，再置入装有液体培养基的容量为250ml的三角瓶，装液量为80ml/250ml ；将三角 瓶置于摇床培养3 4天，摇床的转速160r/min，培养期的环境温度为28士2°C ；结束后以 体积重量比为5%接种量接入固体培养基在28士2°C环境中继续培养6 8天，每隔2 3 天翻拌一次，至产芽孢；最后自然风干或30°C烘干，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为 101Q_nCfU/g。
4.根据权利要求3所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于所述 的固体菌剂粉碎后过20 40目筛，获得内生枯草芽孢杆菌粉剂。
5.根据权利要求3所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于所述 的试管斜面培养基为牛肉膏0. 3克，蛋白胨1. 0克，氯化钠0. 5克，溶解在1000毫升水中， 调节pH 7. 4 7. 6，琼脂15 20克；所述的液体培养基为牛肉膏0. 3克，蛋白胨1. 0克， 氯化钠0. 5克，溶解在1000毫升水中，调 节pH 7. 4 7. 6 ；所述的固体培养基为麸皮、草 炭按照质量配比2 1配制。
6.根据权利要求1或2所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于 所述的水为地下水或至少放置12小时得自来水；所述的间歇好氧环境是指环境中强制通 气与静置等时段交替，即间歇12小时，通气期间溶氧量为2 6mg/L。
7.根据权利要求6所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于所述 的腐熟的堆肥产物是以牛粪、鸡粪和稻秸杆为原料，腐熟的堆肥产物是这样获得的将牛 粪、鸡粪和稻秸杆以1 1 0.2的干物质量比例混合，调节碳氮比=25 30 1，水分含 量调节到60 65%，进行堆肥，堆子高度80 100厘米；当温度逐渐上升到60 65°C持续 2 3天时开始翻堆，以后每隔2 3天翻堆一次，当温度由高温逐渐回落到40 45°C时 即可结束发酵，将堆肥产物自然堆放25 30天进行后熟，后熟产物即为腐熟的堆肥产物。
8.根据权利要求7所述的增强型液体微生物有机肥料的制备方法，其特征在于堆肥 中使用的农作物秸秆的长度为5 6厘米；当粪便的水分含量高于70%，则用自然晒干的 水稻秸秆掺入粪便水中调节水分含量，使其调节至60 65%后再按上述步骤堆肥；堆肥原 料的碳氮比可以通过尿素调节。
全文摘要
本发明涉及一种增强型液体微生物有机肥料的制备方法。是在敞口桶状容器中，将腐熟的堆肥产物与水以1∶8～10的体积比混合，接种微生物菌剂，在室温20～25℃的间歇好氧环境发酵，再用100目筛过滤后获得。其优点是它以牛、鸡粪便及水稻秸秆的腐熟堆肥产物为原料，获得的液体肥料含有作物生长所必须的速效、缓效碳、氮、磷、钾元素等矿物元素，以及大量好氧微生物及它们的代谢产物；由于在液体发酵过程中接种了能在植株体内定殖的内生枯草芽孢细菌，其功能更加明确，靶标性更强，效果更加稳定；本发明发酵过程设备、工艺简单，易于操作，施用后能改良土壤质量、平衡土壤养分及丰富土壤微生物的种群结构，对作物有促生、防病的效果。
文档编号C05F5/00GK101875571SQ20091023233
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者常志州, 张建英, 徐跃定, 李艳霞, 马艳, 黄红英 申请人:江苏省农业科学院